白藜三醇對人臍靜脈內皮細胞血管生成的影響及其可能機制

史彤彤，程明月，張超群，張卓琦，王志榮

白藜三醇對人臍靜脈內皮細胞血管生成的影響及其可能機制

史彤彤，程明月，張超群，張卓琦，王志榮

目的：探究白藜三醇（Res） 對正常狀態下人臍靜脈內皮細胞（HUVEC） 血管生成的影響及其可能機制。

白藜三醇；磷酸化蛋白激酶B；磷酸化內皮型一氧化氮合酶；一氧化氮；血管生成

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:643.)

冠心病在我國的發病率、致殘率及死亡率日趨增高，嚴重危害了人類的健康。冠狀動脈（冠脈）狹窄或閉塞會導致心肌缺血、壞死，當心肌發生缺血、壞死時，機體可代償性的促進內皮細胞增殖、遷移，從而促進梗死周圍區側枝循環的建立，但這種代償不足以滿足機體改善心肌供血的需要，因而 “治療性血管新生”的概念應運而生[1]。治療性血管新生，即缺血區的“自我血管搭橋”，是通過人為因素，包括藥物治療、干細胞移植、基因轉染等來促進缺血區血管新生，從而改善缺血組織的血液供應，已經成為近年來心血管疾病治療研究的熱點。白藜三醇存在于葡萄皮、花生及中藥虎杖等植物中的一種非黃酮類多酚化合物，已被證實具有心血管保護作用，包括延緩動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化等[2-4]。我們前期研究發現，白藜三醇能夠有效促進豬急性閉塞冠脈側枝循環的建立[5]，本實驗將從細胞水平探討白藜三醇對血管生成的影響及可能機制。

1 材料與方法

藥品及試劑：白藜三醇、NG-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（L-NAME，一氧化氮合酶阻斷劑）購于美國Sigma公司，DMEM高糖培養基、胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司。兔抗人蛋白激酶B（Akt）多克隆抗體、兔抗人磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）多克隆抗體和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）阻斷劑（ LY294002）購于美國Cell Signaling Technology公司。兔抗人eNOS多克隆抗體、transwell chamber、Matrigel（GFR）購于美國BD biosciences公司。結晶紫染液、CCK-8試劑盒購于碧云天生物技術研究所。兔抗人磷酸化內皮型一氧化氮合酶（p-eNOS） 購于美國Abcam公司。鼠抗人β-actin單克隆抗體、堿性磷酸酶標記的馬抗小鼠和山羊抗兔IgG均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。NO檢測試劑盒購于南京建成生物公司。

細胞來源：人臍靜脈內皮細胞株（HUVEC）購于美國模式培養物集存庫（ATCC）。

細胞培養：取HUVEC細胞株，復蘇后在37℃、5%CO2培養箱進行細胞培養，待細胞長至80%～90%融合后采用胰蛋白酶（0.25%）消化法按1:3分瓶傳代。

實驗分組：分為DMEM高糖（＜4 500 mg/L）培養基培養組（正常組）、白藜三醇組（藥物組）、白藜三醇+LY294002組（藥物阻斷劑組1）、LY294002組（阻斷劑組1）、白藜三醇+L-NAME組（藥物阻斷劑組2）、L-NAME組（阻斷劑組2）。

CCK-8法檢測細胞增殖：取對數生長期的細胞，參照文獻[6]，以1×104/ml的密度接種于96孔板，分組處理細胞，每組均設5個平行孔。孵育24 h后加入CCK-8，于培養箱繼續培養2 h，用酶標儀于490 nm檢測每孔光密度值（D） 值。細胞增殖率=（D藥物組-D正常組）/D藥物組×100%。

免疫印跡（Westem blot）法檢測Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白的表達：分組處理后細胞用4℃預冷的磷酸鹽緩沖液（含有NaCl、Na2HPO4、KCl、KH2PO4，pH=7.35）清洗干凈，使用含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液在冰上裂解5 min，13 000 g離心15 min（4℃），收集上清，參照文獻[7]按照二喹啉甲酸（BCA）法蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白濃度。蛋白高溫變性，加樣，5%濃縮膠和10%分離膠跑膠，轉膜至聚偏二氟乙烯膜，含5%脫脂牛奶的緩沖液（含有Tris-HCl、NaCl、Tween-20，pH=7.4）封閉3 h，一抗4℃孵育過夜，緩沖液洗3遍，每次10 min，二抗室溫孵育2 h，緩沖液洗3遍，每次10 min，顯色，掃描。

硝酸還原酶法測定細胞培養液一氧化氮（NO）的濃度：參照文獻[8]，取對數生長期的細胞，以1×105/ml的密度接種于24孔板，分組處理細胞，每組均設3個平行孔，收集每孔細胞培養液待檢測。按照試劑盒說明書分步處理，最終各取上清液移至96孔板，用酶標儀于550 nm檢測每孔光密度（D）值，其計算公式如下：NO含量（μmol/L）=（測定管吸光度-空白管吸光度）/（標準管吸光度-空白管吸光度） ×標準品濃度100 μmol/L。

內皮細胞體外遷移實驗：參照文獻[9]，取對數生長期細胞，胰酶消化細胞后用含0.5%胎牛血清培養基重懸細胞，于上室加入100 μl細胞懸液（1×105/孔），下室加入700 μl去血清培養基 ，按照分組處理細胞后，繼續在37℃、5%CO2培養箱進行培養10 h后，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞，下膜用結晶紫染色，中性樹脂封片后顯微鏡下計數（隨機取5個視野）。

內皮細胞的體外小管形成實驗：參照文獻[10]，將基質膠以每孔60 μl鋪于96孔板中（按實驗分組，每組均設 3個平行孔），將96孔板置于37℃培養箱中放置1 h。取對數生長期細胞，胰酶消化細胞后用無血清培養基重懸細胞并以1×104/孔種在基質膠上，按分組處理細胞后，繼續在37℃、5%CO2培養箱進行培養，18 h后鏡下觀察并分析（隨機取5個視野）, 應用Image J軟件分析顯微鏡下每個視野小管數量，結果以與正常組相比的百分數表示。

統計學處理：采用Graphpad Prism 5.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差表示，多組之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白藜三醇對人臍靜脈內皮細胞的增殖的影響

藥物組（1、5 μmol/L）與正常組相比細胞增殖增加（P＜0.01）；藥物組0.2、10、20 μmol/L與藥物組5 μmol/L相比細胞增殖降低（P＜0.01） ，差異有統計學意義，見表1。余實驗選取5 μmol/L白藜三醇。

2.2 白藜三醇對人臍靜脈內皮細胞內蛋白激酶B、磷酸化蛋白激酶B、內皮型一氧化氮合酶、磷酸化內皮型一氧化氮合酶蛋白及細胞培養液內一氧化氮水平表達的影響

5 μmol/L的白藜三醇作用于細胞， p-Akt 在白藜三醇作用10、15、20、30 min后與正常組相比表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05～0.01），p-eNOS、NO在白藜三醇作用15、20 min后與正常組相比表達增加，差異均有統計學意義（P＜0.05～0.01；表2、圖1）。LY294002（10 μmol/L）預孵育細胞1 h后再加入白藜三醇（5 μmol/L）作用10 min，結果表明：藥物組比正常組p-Akt增高（P＜0.01）、p-eNOS（P＜0.05）蛋白及NO水平增加（P＜0.05）；藥物阻斷劑組1較藥物組p-AkT增高（P＜0.01）、p-eNOS 蛋白及NO水平減低，差異均有統計學意義（P＜0.05～0.01）。表3、圖1

表1 白藜三醇對人臍靜脈內皮細胞增值的影響

表1 白藜三醇對人臍靜脈內皮細胞增值的影響

注：與正常組相比**P＜0.01；與藥物組5μ mol/L濃度相比 △△P＜0.01

組別 D值正常組 0.918±0.094藥物組0.2μ mol/L 0.942±0.054△△1μ mol/L 1.134±0.105**5μ mol/L 1.179±0.089**10μ mol/L 0.958±0.064△△20μ mol/L 0.746±0.092△△

表2 白藜三醇作用人臍靜脈內皮細胞不同時間對藥物組p-Akt、p-eNOS及NO水平的影響

表2 白藜三醇作用人臍靜脈內皮細胞不同時間對藥物組p-Akt、p-eNOS及NO水平的影響

注：與正常組相比*P＜0.05 **P＜0.01。p-Akt：磷酸化蛋白激酶B p-eNOS：酸化內皮型一氧化氮合酶 NO：一氧化氮

組別 p-Akt p-eNOS NO(μ mol/L)正常組 1.000±0.000 1.000±0.000 14.38±0.538藥物組5 min 1.074±0.054 1.054±0.068 15.08±0.659 10 min 1.311±0.063** 1.079±0.075 15.53±0.527 15 min 1.247±0.100* 1.184±0.087* 16.79±0.639**20 min 1.244±0.086* 1.202±0.103* 17.06±0.794**30 min 1.234±0.095* 1.058±0.086 15.45±0.654

2.3 白藜三醇對人臍靜脈內皮細胞遷移的影響

藥 物 組（5 μmol/L） 內 皮 細 胞 遷 移 率（138.20±7.413）%大于正常組（100.00±0.000）%（P＜0.01），藥物阻斷劑組2加入L-NAME（3 mmol/L）后內皮細胞遷移率（88.29±5.364）%小于藥物組（P＜0.01），差異均有統計學意義。阻斷劑組2內皮細胞遷移率（86.25±7.469）%與藥物阻斷劑組2相比差異無統計學意義。圖2

表3 各組藥物作用10分鐘后磷酸化蛋白激酶B、磷酸化內皮型一氧化氮合酶蛋白、一氧化氮水平水平比較

表3 各組藥物作用10分鐘后磷酸化蛋白激酶B、磷酸化內皮型一氧化氮合酶蛋白、一氧化氮水平水平比較

注：與正常組比*P＜0.05 **P＜0.01；與藥物組比△P＜0.05 △△P＜0.01。余注見表2

組別 p-Akt p-eNOS NO(μ mol/L)正常組 1.000±0.000 1.000±0.000 14.61±0.855藥物組 1.441±0.061** 1.148±0.062* 16.96±0.929*藥物阻斷劑組1 0.957±0.102△△ 0.907±0.051△△13.42±0.603△阻斷劑組 1 1.012±0.090 0.856±0.074 13.69±0.433

圖1 免疫印跡法分析各組細胞內蛋白激酶B、磷酸化蛋白激酶B、磷酸化內皮型一氧化氮合酶、內皮型一氧化氮合酶的表達（各組蛋白條帶n=3）

圖2 白藜三醇對人臍靜脈內皮細胞遷移的影響(×400)

2.4 白藜三醇對人臍靜脈內皮細胞體外小管形成的影響

藥物組（5 μmol/L）體外小管形成數量（145.20±13.441）%大于正常組（100.00±0.000）%（P＜0.01），藥物阻斷劑組2加入L-NAME（3 mmol/L）后內皮細胞體外小管形成數量（81.39±12.815）%小于藥物組（P＜0.01），差異均有統計學意義。阻斷劑組2內皮細胞體外小管形成數量（67.59±15.307）%與藥物阻斷劑組2相比差異無統計學意義。圖3

圖3 白藜三醇對人臍靜脈內皮細胞體外血管形成的影響（×200）

3 討論

本實驗研究發現，白藜三醇通過上調人臍靜脈內皮細胞NO的表達來發揮血管生成誘導作用，其機制可能是通過PI3K/Akt/eNOS信號通路的激活。

血管生成是從先前存在的脈管系統萌發出新的毛細血管的過程，對于許多病理及生理過程都是必須的[11]。在血管生成過程中，內皮細胞增殖、遷移及形成管腔樣結構，而這一系列的事件都是由細胞因子調控，如血管內皮生長因子（VEGF），胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、NO等，其中NO是由eNOS催化L-精氨酸產生的氣體信號分子，主要通過促進血管舒張、抑制血小板聚集和白細胞粘附來調節心血管功能[12]。有研究表明，在eNOS-deficient的小鼠上建立肢體缺血模型后，對于缺血組織的血管新生應答被損壞，而且注入重組血管內皮生長因子或腺病毒介導的血管內皮生長因子基因轉錄并不能逆轉上述改變[13]。因此，血管內皮生長因子介導的血管新生依賴于NO。eNOS的活性調節可通過多種方式，包括mRNA和蛋白表達量的改變、eNOS信號復合體的形成、細胞內的轉位和特定氨基酸殘基位點的磷酸化[14]，其中位于eNOS羧基端還原酶區域的Ser-1177位點磷酸化對eNOS活性增強很關鍵，其磷酸化水平提高能夠使NO合成增加[15]。本實驗通過檢測白藜三醇作用于HUVEC后Ser-1177位點磷酸化狀態，發現白藜三醇能夠提高其磷酸化水平，說明白藜三醇可通過上調eNOS的酶活性而使HUVEC的NO合成增加。

體外研究中通常通過觀察內皮細胞在基質膠上的小管形成情況來評價內皮細胞的血管生成能力。本實驗結果顯示，一氧化氮合酶阻斷劑L-NAME能夠抑制白藜三醇對HUVEC體外小管形成的促進作用。而在血管生成過程中，細胞遷移是一個重要環節，本實驗通過細胞遷移實驗發現L-NAME同樣抑制了白藜三醇對HUVEC細胞遷移的促進作用。綜上所述，白藜三醇能夠通過上調NO表達來促進HUVEC體外血管生成。

為進一步探究eNOS活性改變的機制，我們檢測了可能引起這個位點磷酸化改變的上游激酶的變化[16]，即Akt蛋白的表達。Akt在信號通路中的上游信號分子有PI3K，活化的PI3K可使Akt從細胞質轉移到細胞膜上．并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）的輔助下，通過使Akt蛋白上的蘇氨酸磷酸化位點（Thr308）和絲氨酸磷酸化位點（Ser473）磷酸化而使其激活，而激活的Akt能夠使下游一系列蛋白活化，從而參與調節細胞的增殖、遷移[17]。本實驗結果顯示，白藜三醇能夠上調Akt的Ser-473位點磷酸化水平，這和白藜三醇引起的eNOS的Ser-1177位點磷酸化水平及NO表達增加相一致，而且加入PI3K阻斷劑LY294002后抑制了Akt、eNOS的活化及NO的生成。所以說，一定濃度的白藜三醇能夠活化PI3K/Akt/eNOS信號通路，促進NO的產生，進而對內皮細胞增殖、遷移及體外小管形成發揮促進作用。

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Effect of Resveratrol on Angiogenesis of Human Umbilical Vein Endothelial Cells With the Possible Mechanisms

SHI Tong-tong, CHENG Ming-yue, ZHANG Chao-qun, ZHANG Zhuo-qi, WANG Zhi-rong.
Department of Cardiology, The Aff i liated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou ( 221002), Jiangsu, China

WANG Zhi-rong, Email: xzzrw@163. com

Objective: To explore the effect of resveratrol (Res) on angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with the possible mechanisms in vitro.Methods: The HUVECs were cultured in 6 groups.①Control group, HUVEC were cultured with high glucose in DMEM, ②Res group, the cell were cultured with Res at different concentrations, ③Res with PI3K blocker LY294002 (Res+Blocker 1) group, ④Blocker 1 group, HUVEC were cultured with LY294002 alone, ⑤Res with eNOS blocker L-NAME (Res +Blocker 2) group and ⑥Blocker 2 group. The effect of Res on HUVEC proliferation was detected by CCK-8 kit, the protein expressions of p-Akt, p-eNOS were examined by Westin blot analysis, nitric oxide (NO) level was measured by nitrate reduction method and the endothelial cell migration was assayed by transwell chamber method.Results: ① Compared with Control group, HUVEC proliferation increased in Res (1, 5μmol/L ) group, P＜0.01, the proliferation in Res (5μmol/L) group was higher than those in Res (0.2, 10, 20μmol/L) group, P＜0.01, while Res(20 μmol/L) group could inhibit the proliferation P＜0.01. ②Compared with Control group, Res (5μmol/L) group had the higher protein expressions of p-Akt, p-eNOS, P＜0.05-0.01, higher NO level, P＜0.05. ③Compared with Res group, Res+Blocker 1 group had lower expressions of p-Akt, p-eNOS, P＜0.01, lower NO, P＜0.05; the expressions of p-Akt, p-eNOS and NO level were similar between Res+Blocker 1 group and Blocker 1 group, all P＞0.05. ④Compared with Control group, the cell migration and tubing formation were higher in Res (5μmol/L) group, P＜0.01; compared with Res group, the cell migration and tubing formation were lower in Res+Block2 group, P＜0.01.Conclusion: Res could up-regulate NO level via activating PI3-K/Akt/eNOS signaling and therefore, improving the proliferation, migration and tubing formation of HUVEC in vitro.

Resveratrol; p-Akt; p-eNOS; NO; Angiogenesis

2014-02-20）

（編輯：常文靜）

221002 江蘇省徐州市，徐州醫學院附屬醫院 心內科

史彤彤 住院醫師 碩士 主要從事冠心病的防治研究 Email：447874025@qq.com 通訊作者：王志榮 Email: xzzrw@163.com

R54

A

1000-3614（2014）08-0643-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.08.021

方法：體外培養HUVEC，實驗分為：DMEM高糖（＜4 500 mg/L）培養基培養組（正常組）、白藜三醇組（藥物組）、白藜三醇+磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）阻斷劑組（LY294002，藥物阻斷劑組1）、LY294002組（阻斷劑組1）、白藜三醇+ NG-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽組（一氧化氮合酶阻斷劑L-NAME，藥物阻斷劑組2）、L-NAME組（阻斷劑組2），其中LY294002為磷脂酰肌醇3-激酶阻斷劑。采用CCK-8法檢測細胞增殖情況；免疫印跡（Western blot）法檢測蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、磷酸化內皮型一氧化氮合酶（p-eNOS）蛋白的表達；亞硝酸還原酶法檢測一氧化氮（NO）的水平；遷移小室（transwell chamber）檢測內皮細胞的遷移能力；小管形成實驗檢測內皮細胞的體外小管形成能力。

結果：①藥物組（1、5 μmol/L）與正常組相比細胞增殖增加（P＜0.01）；藥物組（5 μmol/L）與藥物組（0.2、10、20 μmol/L）相比細胞增殖增加（P＜0.01）；藥物組（20 μmol/L）對細胞增殖有抑制作用（P＜0.01），差異均有統計學意義。②藥物組（5 μmol/L ） 較正常組p-Akt、p-eNOS蛋白表達增加（P＜0.05～0.01），NO水平增加（P＜0.05），差異均有統計學意義；藥物阻斷劑組1 p-Akt、p-eNOS蛋白表達與藥物組比較均減低（P均＜0.01），NO水平減低（P＜0.05）；藥物阻斷劑組1（5 μmol/L）較阻斷劑組1 p-Akt蛋白、p-eNOS蛋白及NO差異均無統計學意義（P 均＞0.05）。③細胞遷移及小管形成實驗：藥物組（5 μmol/L）內皮細胞遷移率及體外小管形成數量大于正常組（P＜0.01），藥物阻斷劑組2內皮細胞遷移率及體外小管形成數量小于藥物組（P＜0.01）。

結論：白藜三醇可能通過激活PI3K/Akt/eNOS信號通路誘導正常狀態下內皮細胞NO水平的增加，從而促進內皮細胞增殖、遷移及體外小管形成。