慢性心肌梗死大鼠室性心律失常的實驗研究*

侯劍峰，張昌偉，鄭哲，胡盛壽

基礎(chǔ)與實驗研究

慢性心肌梗死大鼠室性心律失常的實驗研究*

侯劍峰，張昌偉，鄭哲，胡盛壽

目的：證實大網(wǎng)膜是否通過逆轉(zhuǎn)心臟神經(jīng)重構(gòu)降低心律失常易感性。

大網(wǎng)膜移植；心肌梗死；心律失常；神經(jīng)重構(gòu)

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:924.)

心肌梗死后以交感神經(jīng)過度再生、交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)平衡失調(diào)為特征的心臟神經(jīng)重塑是心肌梗死后室性心律失常和心原性猝死的重要機制之一[1，2]。最近研究顯示：傳統(tǒng)冠心病再血管化技術(shù)—大網(wǎng)膜包裹術(shù)可以用于治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷性和退行性疾病，如腦梗死、阿爾茨海默病及外周神經(jīng)損傷等，并獲得良好療效。本研究旨在觀察大網(wǎng)膜包裹術(shù)對心肌梗死后心律失常易感性的影響，并探討其可能機制。

1 材料和方法

實驗動物與方法：實驗時間為2012-10至2013-07，實驗動物：為SPF級Sprague-Dawley大鼠60只，均由北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，6～8周齡，體重260～280g，雌雄各半。將大鼠隨機分為3組，采用冠狀動脈結(jié)扎法建立心肌梗死模型[3]完成第一次手術(shù)。3周后，使用超聲心動圖篩選大鼠心肌梗死模型[左心室短軸縮短率（LVFS）＜30%，左心室射血分數(shù)（LVEF）＜60%]，再完成第二次手術(shù)：①假手術(shù)組（n=20）：第一次縫線穿過冠狀動脈下方而不結(jié)扎，4周后僅再次開胸；②單純心肌梗死組（n=20）：第一次完成心肌梗死，4周后再次開胸，不移植大網(wǎng)膜；③大網(wǎng)膜移植組（n=20）：第一次完成心肌梗死，4周后再次開胸后，正中開腹將帶蒂大網(wǎng)膜經(jīng)過膈肌打孔移植至心肌梗死及周邊區(qū)。

觀察指標：程序性電刺激方法評估心肌梗死大鼠心律失常易感性[4]（評分法則：室性心動過速持續(xù)不超過15次被認為是非持續(xù)性，反之被認為是持續(xù)性。0分：未誘發(fā)心律失常；1分：三個期前收縮誘發(fā)非持續(xù)性心動過速；2分：三個期前收縮誘發(fā)持續(xù)性心動過速；3分：二個期前收縮誘發(fā)非持續(xù)性心動過速；4分：二個期前收縮誘發(fā)持續(xù)性心動過速；5分：一個期前收縮誘發(fā)非持續(xù)性心動過速；6分：一個期前收縮誘發(fā)持續(xù)性心動過速；7分：基礎(chǔ)刺激能誘發(fā)心動過速；8分：未刺激時心臟即停跳）采用電生理方法評價各組大鼠的電生理特性，免疫組織化學(xué)方法檢測心臟神經(jīng)分布及密度，蛋白免疫印跡檢測連接蛋白43（Connexin43）、神經(jīng)生長因子（NGF）的表達，酶聯(lián)免疫吸附法檢測心肌組織內(nèi)皮素-1（ET-1）的表達。

統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)采用表示，α=0.05為顯著性檢驗水準，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

死亡率：每組20只大鼠納入研究，假手術(shù)組第一次手術(shù)死亡1只，第二次開胸手術(shù)死亡1只，存活18只（90.0%）；單純心肌梗死組第一次手術(shù)死亡2只，第二次開胸手術(shù)死亡1只，存活17只（85.0%）；大網(wǎng)膜移植組第一次手術(shù)死亡3只，二次開胸手術(shù)死亡3只，存活14只（70.0%）。

程序性電刺激方法檢測各組大鼠室性心律失常的易感性結(jié)果：如圖1所示：假手術(shù)組（n=18）未能誘發(fā)室性心律失常；單純心肌梗死組（n=17）共13只（76.4%）大鼠誘發(fā)出室性心律失常，大網(wǎng)膜移植組（n=14）共6只（42.9%）大鼠誘發(fā)出室性心律失常；與單純心肌梗死組相比，大網(wǎng)膜移植組心律失常評分顯著下降（0.9±0.2 vs 3.5±1.2， P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，單純心肌梗死組與大網(wǎng)膜移植組心律失常評分顯著升高（P＜0.05）。

圖1 程序性電刺激誘發(fā)室性心律失常的易感性

自發(fā)狀態(tài)下心肌梗死疤痕區(qū)域心表電位和同步興奮閾值（通過心肌梗死區(qū)域的電刺激信號引起右心室流出道同步興奮的最小刺激強度）：結(jié)果如圖2所示：與單純心肌梗死組相比，大網(wǎng)膜移植組自發(fā)狀態(tài)下信號振幅顯著升高[（3.4±0.3）mV vs（1.5±0.2）mV， P＜0.05]，其同步捕獲閾值顯著降低[（2.2±0.2）mV vs （ 5.5±0.3）mV，P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，大網(wǎng)膜移植組及單純心肌梗死組自發(fā)狀態(tài)下信號振幅顯著降低，其同步捕獲閾值顯著升高（P＜0.05）。

圖2 自發(fā)狀態(tài)下和刺激狀態(tài)下心表電位

免疫組織化學(xué)方法對各組大鼠心臟神經(jīng)密度評價：圖3顯示：在表示心臟交感神經(jīng)的酪氨酸酶（TH）染色中，與單純心肌梗死組比較，大網(wǎng)膜移植組新生神經(jīng)密度顯著下降[（1018.5±124.7）μm2/mm2vs （1552.4±270.3）μm2/mm2，P＜0.05]；表示心臟新生神經(jīng)的神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43（GAP43）染色中，與單純心肌梗死組比較，大網(wǎng)膜移植組交感神經(jīng)密度同樣顯著下降[（768.6±144.1）μm2/mm2vs （1388.4±244.9）μm2/mm2， P＜0.05]。與假手術(shù)組比較，大網(wǎng)膜移植組和單純心肌梗死組新生神經(jīng)密度和交感神經(jīng)密度均顯著升高（P＜0.05）。

Western blot結(jié)果：圖4顯示：與單純心肌梗死組相比，大網(wǎng)膜移植組能顯著提高Connexin43表達（P=0.037）；與假手術(shù)組比較，單純心肌梗死組和大網(wǎng)膜移植組Connexin43表達顯著降低（P＜0.05，圖4A）。與單純心肌梗死組相比，大網(wǎng)膜移植組心肌組織NGF表達水平顯著降低（P=0.021）；與假手術(shù)組比較，單純心肌梗死組和大網(wǎng)膜移植組心肌組織NGF表達水平顯著升高（P＜0.05，圖4B），ELISA結(jié)果顯示：與單純心肌梗死組相比，大網(wǎng)膜移植降低了ET-1的表達水平（P=0.033）；與假手術(shù)組比較，單純心肌梗死組和大網(wǎng)膜移植組ET-1表達顯著升高（P＜0.05，圖4C）。

圖3 免疫組織化學(xué)神經(jīng)染色圖及神經(jīng)密度統(tǒng)計圖

圖4 三組Connexin43、NGF與ET-1表達變化

3 討論

在本研究中，我們主要觀察了大網(wǎng)膜移植對慢性心肌梗死大鼠心律失常易感性及其神經(jīng)重構(gòu)的影響。本研究的主要研究發(fā)現(xiàn)總結(jié)如下：①大網(wǎng)膜移植能改善慢性心肌梗死大鼠心臟電傳導(dǎo)，降低其心律失常易感性；②大網(wǎng)膜移植能降低慢性心肌梗死大鼠心肌組織ET-1和NGF的表達，逆轉(zhuǎn)心臟神經(jīng)重構(gòu)。

室性心律失常誘發(fā)的猝死是心肌梗死患者的主要死亡原因之一，在本研究中，我們證實大網(wǎng)膜移植能降低慢性心肌梗死大鼠的心律失常易感性，并且對其電生理機制進行了初步探索。折返形成是心肌梗死后室性心律失常的主要電生理機制之一，而局部的傳導(dǎo)阻滯是折返形成的必備條件[5，6]。心肌梗死后纖維瘢痕的形成能構(gòu)成結(jié)構(gòu)性的傳導(dǎo)阻滯，因此我們分別記錄了自發(fā)狀態(tài)下心肌梗死疤痕區(qū)域心表電位和同步興奮閾值，研究發(fā)現(xiàn)大網(wǎng)膜移植后，心肌梗死瘢痕區(qū)心外膜自發(fā)電位明顯增加而且同步電活動閾值明顯下降，提示心肌梗死瘢痕區(qū)與正常心肌之間的電信號傳導(dǎo)得到明顯改善，這種改善會減少電信號的傳導(dǎo)阻滯及由此導(dǎo)致的折返形成，進而減少室性心律失常的發(fā)生。Connexin43是介導(dǎo)心肌細胞之間的電信號傳導(dǎo)最重要的縫隙連接蛋白，研究顯示增加心肌梗死后Connexin43的表達能降低室性心律失常的發(fā)生[7]，而競爭性抑制Connexin43的功能則可以增加室性心律失常的發(fā)生[8，9]。我們的實驗結(jié)果表明大網(wǎng)膜移植能增加慢性心肌梗死大鼠梗死周邊區(qū)Connexin43的表達，因此我們推測大網(wǎng)膜能通過增加Connexin43的表達，改善心肌梗死局部心肌細胞之間電信號傳導(dǎo)，加快電傳導(dǎo)速度，進而減少折返以及室性心律失常的發(fā)生。

最近的研究表明心肌梗死后的心臟神經(jīng)重構(gòu)是室性心律失常發(fā)生的重要機制，因此，逆轉(zhuǎn)心臟神經(jīng)重構(gòu)成為干預(yù)室性心律失常的途徑之一[10]。我們的實驗結(jié)果表明：心肌梗死后GAP43+的新生神經(jīng)和TH+的交感神經(jīng)在梗死周邊區(qū)表達明顯增加，提示該區(qū)域的神經(jīng)過度再生，而且主要成分是交感神經(jīng)，而大網(wǎng)膜包裹能夠顯著降低心肌梗死周邊區(qū)GAP43+的新生神經(jīng)和TH+的交感神經(jīng)的表達，提示大網(wǎng)膜包裹可能通過逆轉(zhuǎn)心臟神經(jīng)重構(gòu)降低了慢性心肌梗死大鼠心律失常易感性。

由于心肌梗死后的心臟神經(jīng)再生過程與心臟組織局部的NGF表達呈正相關(guān)[11]。通過ET-1受體拮抗劑可以抑制心肌梗死后的心臟神經(jīng)重構(gòu)[12]。本實驗結(jié)果顯示大網(wǎng)膜移植降低了心肌組織ET-1以及NGF的表達水平，因此可以推測大網(wǎng)膜通過ET-1-NGF途徑下調(diào)慢性心肌梗死大鼠梗死周邊區(qū)交感神經(jīng)密度，逆轉(zhuǎn)了神經(jīng)重構(gòu)，進而降低了大鼠心律失常易感性。

本研究雖然證實了大網(wǎng)膜移植能通過ET-1-NGF通路逆轉(zhuǎn)心肌梗死后的神經(jīng)重構(gòu)，并能通過改善心肌梗死心臟電信號傳導(dǎo)，進而降低慢性心肌梗死大鼠室性心律失常易感性，但還存在不足之處：大鼠由于心臟體積過小，自發(fā)性心律失常的發(fā)生率較低，只能通過程序性電刺激誘發(fā)室性心律失常，這與臨床現(xiàn)象并不完全符合，因此，需要開展大動物實驗以進一步的證實大網(wǎng)膜移植降低室性心律失常的作用效應(yīng)及其機制。

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Omentopexy Decreasing the Susceptibility of Ventricular Arrhythmia in Experimental Rats With Chronic Myocardial Infarction

HOU Jian-feng, ZHANG Chang-wei, ZHENG Zhe, HU Sheng-shou.
Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

HU Sheng-shou, Email: shengshouhu@yahoo.com

Objective: To conf i rm the omentopexy decreasing the susceptibility of ventricular arrhythmia in experimental rats with chronic myocardial infarction (MI) by nerve remodeling.Methods: The MI model of SD rats was established by left coronary artery ligation. 3 weeks later, the qualif i ed animals were randomized into 3 groups for the 2ndoperation.① Sham operation group, the rats received the 2ndoperation without ligation,② Isolated MI group, the rats received the 2ndoperation without omentopexy, ③ Omentopexy group, the rats received the 2ndoperation with omentopexy. n=20 in each group. 4 weeks after the 2ndoperation, the electrophysiological characteristics were assessed by relevant techniques, the new and sympathetic nerves in MI border zone were examined by immunohistochemistry, the protein expressions of connexin43 and nerve growth factor (NGF) were measured by western blot analysis and the cardiac endothelin-1 (ET-1) level was evaluated by ELISA.Results: Compared with Isolated MI group, Omentopexy group showed decreased susceptibility of arrhythmia (3.5 ± 1.2) vs (0.9 ± 0.2), improved electrical transduction (1.5 ± 0.2) mV vs (3.4 ± 0.3) mV and decreased capture threshold (5.5 ± 0.3) mV vs (2.2 ± 0.2) mV, all P＜0.05. Compared with Isolated MI group, immunihistochemisty indicated that Omentopexy group had decreased new and sympathetic nerves in MI border zone, as for GAP43: (1388.4 ± 244.9) μm2/mm2vs (768.6 ± 144.1) μm2/mm2, for TH: (1552.4 ± 270.3) μm2/mm2vs (1018.5 ± 124.7) μm2/mm2, all P＜0.05. Western blot analysis showed thatOmentopexy group had the lower NGF expression and higher connexin43 expression; ELISA demonstrated that Omentopexy group had the lower ET-1 expression, P＜0.05.Conclusion: Omentopexy may decrease the susceptibility of ventricular arrhythmia after MI in experimental rats, which might be related to the cardiac nerve remodeling.

Omentopexy; Myocardial infarction; Arrhythmia; Nerve remodeling

2014-08-04）

（編輯：汪碧蓉）

國家國際科技合作項目（2010DFA32620） 北京市科技新星計劃（Z111107054511080） 協(xié)和青年科研基金項目（2013XHQN03）

100037 北京市，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國家心血管病中心 阜外心血管病醫(yī)院 心血管疾病國家重點實驗室

侯劍峰 主治醫(yī)師 博士 主要從事冠心病外科基礎(chǔ)與臨床研究 Email: hjf2006111@163.com 通訊作者：胡盛壽

Email: shengshouhu@yahoo.com

R54

A

1000-3614( 2014 ) 11-0924-04

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2014.11.018

方法：將大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組（n=20），單純心肌梗死組（n=20）和大網(wǎng)膜移植組（n=20）。4周后分別采用電生理方法評價各組大鼠的電生理特性，免疫組織化學(xué)方法檢測心臟神經(jīng)分布及密度，蛋白免疫印跡檢測連接蛋白43（Connexin43）、神經(jīng)生長因子（NGF）的表達，酶聯(lián)免疫吸附法檢測心肌組織內(nèi)皮素-1（ET-1）的表達。

結(jié)果： 與單純心肌梗死組相比，大網(wǎng)膜移植組大鼠心律失常易感性顯著下降（評分：0.9±0.2 vs 3.5±1.2，P＜0.05），電傳導(dǎo)阻滯得到顯著改善[信號振幅：（3.4±0.3）mV vs （1.5±0.2）mV， P＜0.05；捕獲閾值：（2.2±0.2）mV vs （5.5±0.3）mV， P＜0.05]；免疫組織化學(xué)顯示大網(wǎng)膜包裹顯著降低了心肌梗死周邊區(qū)新生神經(jīng)以及交感神經(jīng)密度[神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43（GAP43）：（768.6±144.1）μm2/mm2vs （1388.4±244.9）μm2/mm2， P＜0.05；酪氨酸酶（TH）：（1018.5±124.7）μm2/mm2vs （1552.4±270.3）μm2/mm2， P＜0.05]；蛋白免疫印跡結(jié)果表明大網(wǎng)膜移植組NGF表達下調(diào)而Connexin43的表達上調(diào)，酶聯(lián)免疫吸附法顯示大網(wǎng)膜移植組ET-1的表達下調(diào)（P＜0.05）。

結(jié)論：大網(wǎng)膜包裹能減低慢性心肌梗死大鼠心律失常易感性，而且這種作用可能與心肌梗死后心臟神經(jīng)重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)有關(guān)。