心房肌基質金屬蛋白酶及其抑制劑、凋亡相關基因表達改變與增齡性心房顫動關系的研究*

董麗君，湯寶鵬，周賢惠，李晉新，張宇，孫凌，李耀東，張疆華，邢強，許國軍

心房肌基質金屬蛋白酶及其抑制劑、凋亡相關基因表達改變與增齡性心房顫動關系的研究*

董麗君，湯寶鵬，周賢惠，李晉新，張宇，孫凌，李耀東，張疆華，邢強，許國軍

目的：本研究目的是為論證在增齡性心房顫動（房顫） 時基質金屬蛋白酶-9鏈（MMP-9）與基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、抗凋亡基因（BCL-2）與促凋亡基因（BAX）的表達改變是否與心房結構重構有關，以期為增齡性房顫的發病機制及藥物干預提供可能的策略與思路。

心房顫動；增齡；心房結構重構；心房纖維化；細胞凋亡

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1034.)

心房重構被認為是心房顫動（房顫）持續的根本原因，包括電重構、結構重構和收縮重構[1]。結構重構可能是心肌細胞去分化的適應過程，是心房肌本身的自我防御，也可被理解為一種不良適應過程，即心肌細胞被纖維組織替代的退化進程[2]。房顫時從細胞、離子通道、以及分子水平均發生明顯的改變。而基質金屬蛋白酶（MMPs）和其內源性抑制劑[金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）]的表達調控近年來被認為與心房纖維化重構關系密切[3]。盡管其過程各具不同特征，所有的適應過程最終表現為細胞存活，部分發生結構重構的心肌細胞可能激活程序性細胞死亡過程[4]。而且，這個動態過程受抗凋亡基因（BCL-2）與促凋亡基因（BAX） 表達的調控[5]。

本研究通過慢性房顫犬模型，為進一步闡明伴隨著心房老化或者在房顫這種疾病狀態下，MMP-9與 TIMP-1，BCL-2與BAX的表達改變是否與心房結構重構有關，包括組織形態及細胞超微結構的改變、加速的纖維化和細胞凋亡，以期為增齡性房顫的發病機制及藥物干預提供可能的策略與思路。

1 材料與方法

實驗動物：本實驗于2013-04至2014-04進行。選雜種犬28只，雌雄兼有，體重18～26（19.64±5.87）kg，常規行12導心電圖、心臟彩超并結合獸醫體檢評價為健康犬。根據不同年齡分為成年犬14只，平均年齡（2.2±0.3）歲, 其中成年竇性心律犬和成年慢性房顫犬各7只；老年犬14只，平均年齡（8.8±1.75）歲，其中老年竇性心律犬和老年慢性房顫犬各7只。該實驗方案經新疆醫科大學動物實驗中心倫理委員會審核批準并結合美國國立衛生研究所1996年制定的有關動物實驗倫理原則為指導實施。

犬慢性房顫模型的建立：實驗犬術前12小時禁食水，常規消毒鋪巾。鹽酸氯胺酮（100 ml/2 ml） 1支、地西泮（10 mg/2 ml）1支、阿托品（0.5 mg/ ml）1支，混合后稀釋1倍，劑量：15 mg/kg，肌內注射基礎麻醉后，建立靜脈通道，枸櫞酸芬太尼注射液0.1 mg靜推。氯化琥珀膽堿注射液（司考林）300 mg與枸櫞酸芬太尼注射液0.1 mg溶于250 mL 0.9%氯化鈉注射液中靜脈滴注維持肌肉松弛。待犬的狀況穩定后行氣管插管，呼吸機輔助呼吸，調節氧流量4～6 L/min，潮氣量為20 mL/kg，呼吸壓力0～2 kPa。分別在雙后肢和前肢刺入5號針頭，按照標準連接心電圖導線，動態記錄犬正常II導聯心電圖。取右側臥位，左側胸部剪除犬毛，用碘酒、酒精消毒手術區，左4～5肋間隙為切口，逐層切開皮膚、皮下肌層，開胸器放于切口中，逐層開胸打開心包，暴露左心耳，采用荷包縫合將起搏電極縫合固定于左心耳底部。用起搏分析儀測量各項電參數（電壓閾值＜1 mV，阻抗500～1000 Ω），然后將電極尾端與實驗用動物埋藏式高頻心臟起搏器相連，用lead-2000多導電生理記錄儀，描記標準體表心電圖，磁鐵靠近后開啟起搏器，起搏頻率600次/分，觀察起搏器工作狀態，若起搏狀態良好，快速起搏后出現房顫，關閉起搏器，檢查心包、胸腔無出血后將起搏器埋藏于胸部皮下囊袋內。術畢關閉胸腔，逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚，無菌紗布包扎切口。術后使用頭孢唑啉鈉針1.5 g，2次/日，連續靜點3天預防感染，鹽酸嗎啡注射液20 mg皮下注射止痛，營養支持1周，觀察犬的生命體征。待一般情況穩定后開啟起搏器予以連續起搏4周左右，動態監測心電圖證實為持續性房顫。

實時熒光定量聚合酶鏈反應實驗（ RealtimePCR）：①取100 mg左心耳組織，用Trizol（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA，美國）一步法提取總RNA。取2 μg總RNA參照逆轉錄試劑盒（Bio-Rad, Hercules, CA，美國）進行操作逆轉錄成cDNA。②引物序列：（TaKaRa Biotechnology, 中國大連）。③Real-timePCR體系（25 μl）：待測樣品cDNA稀釋5倍，然后取cDNA 2 μl，SybrGreen qPCR Master Mix 12.5 μl（Applied Biosystems,Carlsbad, CA，美國），上游引物（10 μM）0.5 μl，下游引物（10 μM）0.5 μl，ddH2O 9.5 μl。④反應條件：95℃預變性2 min，隨后進入PCR 循環，95℃變性10 s，56℃褪火30 s，72℃延伸40 s，40個循環。反應完成后根據Ct值計算2-△Ct得出目的基因的 mRNA相對表達量。⑤電泳：取目標基因及內參照基因β肌動蛋白（β-actin）PCR產物5 μl，用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳，在BIO-RAD凝膠成像系統上掃描獲得目標基因產物的電泳圖像。

蛋白質免疫印跡法（Western blot）：組織總蛋白提取按試劑盒（北京索萊寶）說明操作，總蛋白含量按 BCA法測定[6]。聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離總蛋白，每孔上樣量為50 μg，然后將膠上的蛋白通過電轉印跡到硝酸纖維素 （NC）膜上。5%脫脂奶粉/TBS液封閉、洗脫后加入1抗體或β-actin抗體（工作濃度1：2000）進行雜交，4℃孵育過夜，經辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔-IgG（工作濃度1：2000）Ⅱ抗孵育1 h，進行二氨基聯苯胺（DAB）顯色，所有雜交信號在BIO-RAD凝膠成像系統進行掃描定量。

心肌光鏡和超微結構檢測：取自左心房的組織被立即固定在4℃的4%低聚甲醛溶液中并包埋石蠟中。利用光學顯微鏡分別對被蘇木精和伊紅染色以及馬森三色染色（Masson）的半薄切片（2 μm）進行觀察。每個取材點至少兩個切片，每個切片至少200個有核細胞被分析以量化心肌細胞肌溶解和纖維化的程度，其范圍以數字圖像自動測量，利用電子顯微鏡觀察被醋酸鹽和檸檬酸鉛染色的各個樣本的超薄切片（50～100 nm）。

應用TUNEL法檢測心房肌細胞凋亡：應用電鏡觀察竇性與房顫犬心房肌細胞超微結構，計算其凋亡指數（AI），觀察分析增齡性房顫動態演變中伴隨的細胞凋亡與結構重構。

統計學處理：研究數據均以Excel數據庫錄入，數據的統計分析采用SPSS13.1統計軟件包進行，計量資料用均數±標準差描述，首先對數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗后兩組間比較采用方差檢驗，變量間相互關系采用直線相關分析，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1纖維化改變：圖1所示，所有的成年犬與老年犬比較，在老年犬左心房心肌組織肌細胞之間的纖維組織顯得更加致密且緊湊，肌束被大量的結締組織分隔開，以膠原的過度積聚為特征，結締組織[成年犬（4.1±0.9）% vs老年犬（ 8.4±1.0）%，P＜0.05]更多的沉積被顯現。此外，在相同年齡的竇性心律犬和慢性房顫犬之間的比較中顯示，慢性房顫犬的心肌纖維化均更加明顯[成年竇性心律犬和成年慢性房顫犬之間（4.1±0.9）% vs （14.7±2.1）%，P＜0.01；老年竇性心律犬和老年慢性房顫犬之間（8.4±1.0%） vs （18.2±2.4）%，P＜0.01）]，在肌束之間的纖維組織排列更加紊亂無序。

圖1 左心房心肌組織纖維化表現光鏡圖

2.2細胞超微結構的改變：圖2所示，圖2A示成年竇性心律犬左心房肌細胞肌原纖維節排列有序，線粒體大小均一，在核膜內染色質結構正常；圖2B示老年竇性心律犬肌細胞超微結構異常，肌原纖維節出現了一定程度的退化，一些線粒體嵴膨脹且密度減小，伴著染色質及核膜變形的核固縮，脹大的內質網，增多的糖原，更加致密且緊湊的肌纖維；圖2C示成年慢性房顫犬肌細胞超微結構更加異常，肌原纖維節出現了嚴重的退化，線粒體膨脹明顯，核固縮伴隨著部分細胞凋亡，可見一些次級溶酶體，腫大的內質網，較少的糖原，紊亂而無序的肌纖維；圖2D示老年慢性房顫犬肌細胞超微結構明顯異常，肌原纖維節出現了更加嚴重的退化，線粒體空泡變性，嚴重的核固縮伴隨著更多的細胞凋亡，更多的次級溶酶體，明顯腫大的內質網和一些肌絲的崩解。

圖2 左心房心肌組織細胞超微結構改變電鏡圖

2.3細胞凋亡：老年犬較成年犬的左心房肌細胞肌溶解比例增高，細胞凋亡的TUNEL陽性率明顯地增高[（32.9±3.4）% vs （22.0±5.5） %，P＜0.05）]，多數細胞核帶著弱的TUNEL染色且其中異染色質體積增大而均勻分布（圖3A、3B ）。慢性房顫犬較竇性心律犬細胞凋亡的陽性率均顯著地增高[成年慢性房顫犬和成年竇性心律犬之間（33.4±3.9）% vs（22.0±5.5）%，P＜0.01；老年慢性房顫犬和老年竇性心律犬之間（51.2±3.4）% vs（32.9±3.4）%，P＜0.001]，老年慢性房顫犬增高最為明顯，而且一些已固縮的細胞核帶著強的TUNEL染色（圖3C、3D）。

2.4左心房肌MMP-9/ TIMP-1和BCL-2/BAX在mRNA 和蛋白質表達水平的改變：老年竇性心律犬與成年竇性心律犬比MMP-9和BAX在mRNA和蛋白質表達水平均顯著地增高（P＜0.05）；而TIMP-1和BCL-2在mRNA和蛋白質表達水平均顯著地下降（P＜0.05），差異有統計學意義。在相同年齡的竇性心律犬和慢性房顫犬之間的比較中顯示，成年和老年慢性房顫犬的MMP-9和BAX在mRNA 和蛋白質表達水平均顯現出有意義的上調趨勢（P＜0.05），尤其是老年房顫犬這種上調趨勢最為明顯（P＜0.05）；相反，成年和老年慢性房顫犬的TIMP-1和BCL-2在mRNA 和蛋白質表達水平均顯現出有意義的下調趨勢（P＜0.05），尤其是老年房顫犬這種下調趨勢最為明顯（P＜0.05），差異均有統計學意義。表1、表2

表1 成年犬和老年犬竇性心律與慢性房顫時左心房心肌組織MMP-9、TIMP-1和BCL-2、BAX在mRNA表達水平比較（n=7，

表1 成年犬和老年犬竇性心律與慢性房顫時左心房心肌組織MMP-9、TIMP-1和BCL-2、BAX在mRNA表達水平比較（n=7，

注：與竇性心律成年犬比較aP＜0.05；與同年齡竇性心律比較bP＜0.05。MMP-9 ：基質金屬蛋白酶-9 TIMP-1：基質金屬蛋白酶抑制劑-1 BCL-2：抗凋亡基因 BAX：促凋亡基因

MMP-9 TIMP-1 BAX BCL-2成年竇性心律犬 1.1483±0.2371 3.1602±0.3029 1.2520±0.2831 2.9571±0.3745老年竇性心律犬 1.8520±0.3029a 2.1139±0.2273a 1.9520±0.1824a 1.8623±0.3382a成年慢性房顫犬 2.1372±0.2981b 1.9126±0.3812b 2.7361±0.2937b 1.5620±0.2490b老年慢性房顫犬 2.8072±0.3369b 1.1683±0.1927b 3.2532±0.3271b 0.8524±0.2176b

表2 在竇性心律與慢性房顫時成年犬和老年犬左心房心肌組織MMP-9、TIMP-1和BCL-2、BAX在蛋白質表達水平比較（n=7，

表2 在竇性心律與慢性房顫時成年犬和老年犬左心房心肌組織MMP-9、TIMP-1和BCL-2、BAX在蛋白質表達水平比較（n=7，

注：與竇性心律成年犬比較aP＜0.05；與同年齡竇性心律比較bP＜0.05。余注見表1

MMP-9 TIMP-1 BAX BCL-2成年竇性心律犬 0.1738±0.0329 0.7620±0.0572 0.2165±0.0263 0.6850±0.0562老年竇性心律犬 0.3093±0.0462a 0.5833±0.0429a 0.4281±0.0390a 0.5192±0.0509a成年慢性房顫犬 0.4473±0.0528b 0.3982±0.0320b 0.5018±0.0472b 0.3278±0.0297b老年慢性房顫犬 0.6172±0.0627b 0.2207±0.0313b 0.7163±0.0572b 0.1629±0.0162b

圖3 比較各組左心房心肌組織細胞凋亡的TUNEL染色變化

3 討論

心肌纖維化是一個動態的過程，其中正常的膠原鏈被降解，取而代之的是纖維性的間質沉著物，金屬蛋白酶與基質的降解和膠原的合成關系密切。房顫時由于細胞因子介導的MMPs/TIMPs系統間相互作用的失衡，使細胞外基質重構，這可能是房顫是心房結構重構的機制之一[7]。伴隨著心房老化或者在房顫這種疾病狀態下，金屬蛋白酶在保持細胞外基質的平衡中起到至關重要的作用，這些蛋白水解酶在轉錄和翻譯水平受內源性生理抑制劑如TIMPs的調控。在大多數疾病過程中，MMPs和TIMPs相互作用的動態過程將決定表型變化，促纖維化信號的強弱將決定二者的平衡。此外，促纖維化信號可以刺激成纖維細胞增生和纖維連接蛋白、膠原I和III、葡聚糖蛋白及其它細胞外基質成分的沉積[8-10]。本研究發現在老年犬中受損的基質降解的證據，與成年犬比較，MMP-9在mRNA和蛋白質水平表達增高而TIMP-1表達下調。而TIMP-1表達下調被認為與左心房、左心室擴大密切相關。因此，TIMP-1表達異常將可能導致左房擴大、心肌細胞肥大和收縮功能喪失。依次地，被改變的MMP-9/ TIMP-1化學計量學效能可能導致對MMP-9生物效能的失控，MMP-9高表達將導致心房纖維化加重。在組織壞死因子、血管緊張素及細胞因子等共同參與下[11,12]，MMPs和TIMPs比例更加失衡從而導致心房結構重構。

本研究發現，老年犬左心房組織結構的最大變化是分布在肌細胞之間的纖維組織過度增生，尤其在老年房顫犬心房組織中這種纖維化程度更加明顯，既往諸多的研究證實[13,14]，間質纖維化可以減低心肌細胞間的電耦聯，從而阻礙了心肌細胞及肌束之間的電傳導。其直接的后果是心房肌由標準的均一性傳導而轉向不均一的各向異性傳導，這種纖維化優先地影響細胞間橫向聯結而非縱向傳導，這將引起更加緩慢而曲折的傳導播散。由此我們推測，發生在老年心房肌的期前刺激在傳導過程中更易出現單向阻滯和傳導延緩從而易導致折返，這種由纖維化導致心房電和結構重構易成為老年心房潛在的致房性心律失常的機制。

本研究發現，伴隨著心房老化或者在房顫這種疾病狀態下，老年竇性心律犬與老年房顫犬心房肌含有更多的凋亡細胞。與成年竇性心律犬的比較中，老年竇性心律犬BAX高表達而BCL-2低表達，同樣地，這種異常的表達在成年與老年房顫犬中亦顯現出來。由此我們認為，盡管促細胞凋亡和與之相反的保護機制共存，但是，伴隨著心房老化或房顫這種疾病狀態下，在左心房心肌組織中具有保護機制的蛋白表達呈現下降趨勢而促凋亡的蛋白表達呈現上升趨勢，這種狀態的持續最終導致左心房肌細胞凋亡的發生。

以往的研究結果顯示，BCL-2可以誘導心肌細胞處于“代謝冬眠狀態”，這將能提高心肌細胞對于應急傷害的耐受力。由于細胞凋亡需要能量，伴隨嚴重的ATP耗竭隨之而來的是壞死而非細胞凋亡[15]。正如前所述，心肌細胞凋亡是“溫和的”而反復性的長期過程，伴隨著心房老化或者在房顫這種疾病狀態下所出現的，如局部缺血、緊張、負荷過重等長期的應急狀態，這將漸進地抑制了保護機制（如BCL-2低表達）而激活了促凋亡徑路（如BAX高表達）。尤其對于衰老的心房，額外的較小傷害性刺激如高頻心率便足以以隨機的方式促發本已脆弱的心肌細胞凋亡。如何定義程序性細胞存活和死亡分界點仍然是大的挑戰。所以我們認為，這種伴隨增齡與房顫而顯現的MMP-9與 TIMP-1，BCL-2與BAX改變可能是增齡性房顫心房重構的分子機制之一。

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Relationship Between Atrial MMP-9/TIMP-1 With Apoptosis Related Gene and Aging With Atrial Fibrillation in Experimental Dog Model

DONG Li-jun, TANG Bao-peng, ZHOU Xian-hui, LI Jin-xin, ZHANG Yu, SUN Ling, LI Yao-dong, ZHANG Jiang-hua, XING Qiang, XU Guo-jun.
Department of Cardiology, First Aff i liated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi (830011), Xinjiang, China

TANG Bao-peng, Email: tangbaopeng@126.com

Objective: To explore the relationship between atrial MMP-9 with its inhibitor (TIMP-1), anti-apoptosis gene (BCL-2) with apoptosis gene (BAX) and the aging with atrial remodeling in experimental dog model during atrial fi brillation (AF), in order to better deal with the aging caused AF.Methods: The experimental dogs were divided into 4 groups: ①Adult with sinus rhythm (ASR) group, ②Elder with sinus rhythm (ESR) group and ③Adult with AF (AAF) group, ④Elder with AF (EAF) group. n=7 in each group. Chronic AF model was induced by rapid and persistent atrial pacing. The mRNA and protein expressions of MMP-9, TIMP-1 and BCL-2, BAX were measured by real time quantitative RT-PCR and Western blot analysis. The cellular ultra structural remodeling was examined by optical/electron microscopy, and the apoptosis index was determined by TUNEL method,Results: Compared with adult dogs, the elder dogs showed obviously increased expressions of MMP-9, BAX, and decreased expressions of TIMP-1, BCL-2, all P＜0.05. Compared with SR gods, the AF dogs presented up-regulated expressionsof MMP-9, BAX, all P＜0.05, and down-regulated expressions of TIMP-1, BCL-2, all P＜0.05, such changes were most obvious in elder AF dogs. Accompanying with the aging and AF, the degree of atrial fi brosis, cellular ultra structure and the apoptosis index were changed with the statistic meaning.Conclusion: The abnormal expressions of MMP-9/TIMP-1 and BCL-2/BAX might be one of the molecular mechanisms for aging caused AF in experimental dog model.

Atrial fi brillation; Aging; Atrial remodeling; Atrial fi brosis; Apoptosis

2014-05-12）

（編輯：常文靜）

新疆維吾爾自治區自然科學基金（2011211A074）

830011 新疆維吾爾自治區烏魯木齊市， 新疆醫科大學第一附屬醫院 心臟中心

董麗君 住院醫師 碩士研究生 主要研究方向為心律失常的電生理機制 Email: junjun19870817@163.com 通訊作者：許國軍

Email: xuguojun2001@126.com

R54

A

1000-3614（2014）12-1034-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.018

方法：通過持續快速心房起搏建立慢性房顫犬模型，用實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）和蛋白免疫印跡（Western blot）方法檢測4組犬（成年竇性心律犬，老年竇性心律犬，成年慢性房顫犬，老年慢性房顫犬各7只）MMP-9與 TIMP-1、BCL-2與BAX在mRNA和蛋白質表達水平變化。應用光鏡、電鏡及TUNEL法分別檢測細胞結構重構和細胞凋亡。

結果：與成年竇性心律犬比較，老年犬MMP-9和BAX在mRNA和蛋白質的表達均顯著地增高（P＜0.05），而TIMP-1和BCL-2的表達均顯著地下降（P＜0.05）；與竇性心律犬比較，房顫犬MMP-9和BAX表達水平均顯現出有意義的上調趨勢（P＜0.05），尤其是老年房顫犬最為明顯；TIMP-1和BCL-2表達水平均顯現出有意義的下調趨勢（P＜0.05），尤其是老年房顫犬最為明顯。伴隨老齡與房顫，犬心肌纖維化程度、細胞超微結構及凋亡指數均顯現出有統計學意義的改變。

結論：伴隨增齡與房顫而顯現的MMP-9與 TIMP-1，BCL-2與BAX改變可能是增齡性房顫心房重構的分子機制之一。