以糖蜜為碳源的釀酒酵母培養基的優化

陳雪，甄玉國，2*，趙小麗

以糖蜜為碳源的釀酒酵母培養基的優化

陳雪1，甄玉國1，2*，趙小麗1

（1.吉林農業大學動物科學技術學院吉農博瑞奶牛研發中心，吉林長春130118；2.長春博瑞飼料集團有限公司技術中心，吉林長春130114）

以甜菜糖蜜為碳源，通過搖瓶試驗，在單因素試驗基礎上，進行正交試驗設計，對釀酒酵母的培養基進行了優化。最終確定釀酒酵母的液體培養基優化配方為糖蜜添加量8%，尿素添加量0.05%，磷酸二氫鉀添加量0.05%。在此條件下的培養基產釀酒酵母菌干質量為7.67g/L，比培養基優化前提高了23.3%。

甜菜糖蜜；釀酒酵母；培養基；優化

酵母菌（yeast）不是一個分類單位，其屬于子囊菌亞門中的酵母菌科和半知菌亞門中的芽孢綱，菌體為單一細胞，主要以芽殖方式進行無性繁殖[1]。酵母培養物（yeast culture，YC）是指在特定工藝條件下由酵母菌在培養基上經過充分的厭氧發酵后形成的微生態制品，主要由酵母細胞外代謝產物、經發酵后變異的培養基和少量無活性的酵母細胞構成[2]。

酵母菌生長主要受碳源、氮源、生長因子和無機離子等培養基組分的影響。傳統培養基質大多用價格較高的酵母粉和蛋白胨，糖蜜作為制糖廠的廢料，價格低廉，來源廣泛。甜菜糖蜜是糖廠的副產品，可發酵性糖的含量一般為30%～60%，除此之外，還含有一定的可發酵性氮、多種無機鹽及維生素，是酵母生產中比較理想的碳源[3]。以甜菜糖蜜為主要碳源，以期獲得較高釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生物量的培養基配方，為將來優選釀酒酵母的培養及酵母飼料工業化生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）：動物科學技術學院實驗室分離保存。

甜菜糖蜜：黑龍江依安糖廠。

葡萄糖、磷酸二氫鉀、尿素、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鈣（以上均為分析純）：北京化工廠；蛋白胨（總氮≥14.5%，酵母浸粉：總氮≥9%）：北京奧博星生物技術有限公司。

1.1.2 培養基

斜面培養基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，瓊脂15g/L。

液體培養基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）培養基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L）用于種子液培養[4]。

1.2 儀器與設備

pHS-2C型數字式酸度計：上海SANXIN公司；UV-1201分光光度計：日本島津公司；Eppendorf 5810R高速冷凍離心機：德國艾本德股份公司；YP1200型電子天平：上海精科實業有限公司；HYG-C型培養搖床：上海欣蕊自動化設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化與種子液制備

無菌條件下接1環保藏菌種至YPD斜面培養基進行劃線，30℃靜置培養48h復蘇菌種。

取復蘇后的菌種，用接種環取1環活化后的斜面菌種轉接到種子培養基中于30℃、180r/min條件下培養24h（裝液量100mL/250mL）。

1.3.2 分析方法

菌液濃度采用比濁法測定：用紫外可見分光光度計以不接入菌液的培養基作為對照，測定菌液在波長560nm處的光密度值OD560nm值[5]。

測定菌體干質量采用干重法測定：發酵液在5 000r/min條件下離心10min，蒸餾水洗滌2次后收集菌體，105℃烘干至質量恒定，稱質量并記錄數據[6]。

1.3.3 試驗菌株生長曲線測定

斜面保存的菌種用接菌環挑取1環于YPD培養基中，裝液量200mL/500mL，在溫度30℃、180r/min的條件下培養，每隔2h取樣，在波長560nm條件下測定其OD560nm值，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制生長曲線，選擇對數期生長的菌液進行后續試驗[7]。

1.3.4 培養基優化單因素試驗

（1）糖蜜添加量的篩選

培養初始條件：接種量4%，裝液量20mL/100mL三角瓶，溫度30℃，180r/min，pH5.0，培養24h。以糖蜜作為試驗菌種的碳源，分別選取糖蜜添加量4%、6%、8%、10%、12% 5個梯度進行試驗，每組5個平行，利用可見分光光度計在波長560nm條件下測定其吸光度值OD560nm。

（2）培養基最適氮源的篩選[8]

氮源分為有機氮和無機氮，為保持菌種的正常生長在選取的碳源基礎上添加適量的氮源，選取的氮源分別為尿素、硫酸銨和蛋白胨，培養初始條件不變，在保持氮元素添加量水平相同的情況下，添加量分別為尿素0.10%、硫酸銨0.22%、蛋白胨0.33%，以糖蜜培養基為對照組，每組5個平行，在波長560nm條件下測定其OD560nm值。

（3）最適氮源添加量的確定

氮源確定后選取0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%5個梯度進行單因素試驗，每組5個平行，在波長560nm條件下測定其OD560nm值。

（4）培養基中磷酸鹽的篩選

培養初始條件不變，選取磷酸二氫鉀為磷酸鹽，磷酸二氫鉀是酵母代謝中一些關鍵酶的輔助因子（如果糖激酶等），同時也是維持電位差和滲透壓的重要物質[9]。選取磷酸二氫鉀0.01%、0.05%、0.10%、0.20%4個梯度進行單因素試驗，以糖蜜培養基為對照組，每組5個平行，在波長560nm條件下測定其OD560nm值。

（5）糖蜜培養基中無機鹽的篩選

無機鹽是酵母菌生長必不可少的營養物質，培養基中添加無機鹽可促進酵母菌的生長，提高細胞生物量[10]。在確定碳源、氮源和磷酸鹽添加量的基礎上，分別添加0.05%硫酸鎂、0.05%甘氨酸、0.05%氯化鈉、0.05%氯化鈣，判定其是否對菌體生長有促進作用，以糖蜜培養基為對照，每組5個平行，在波長560nm條件下測定其OD560nm值。

（6）糖蜜培養基中生長因子的篩選

選取酵母浸粉為生長因子，生長因子主要是調節微生物代謝活動的，是微生物不可缺少的微量有機元素[11]。選取0.01%、0.05%、0.10%、0.20%4個梯度進行單因素試驗，以糖蜜培養基為對照，每組5個平行，在波長560nm條件下測定其OD560nm值。

1.3.5 培養基配方優化正交試驗

在單因素試驗基礎上，選取對菌體濃度影響較大的因素設計L9（34）正交試驗，以OD560nm值為考察指標，對其培養基組分進行優化。

1.3.6 數據處理

用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行單因素方差分析，采用Duncan檢驗，各組數據以χˉ±s表示。

2 結果與分析

2.1 酵母菌生長曲線

圖1 酵母菌生長曲線Fig.1 Growth curve ofSaccharomyces cerevisiae

由圖1可知，通過對酵母菌的生長曲線分析可知，0～6h為遲緩期，菌體生長較慢。6～16h為對數期，16h后進入穩定期，為保證得到足夠數量的菌體，因此選擇18h左右的菌體進行培養基的單因素篩選。

2.2 糖蜜添加量的確定

由圖2可知，在糖蜜添加量小于10%時，酵母菌的濃度隨糖蜜添加量的提高而增大，當糖蜜添加量大于10%時酵母菌的生長受到抑制，這與王鵬等[12]的研究結果相一致。糖蜜添加量為6%、8%、10%、12%時，各組之間差異不顯著（P＞0.05），但與4%的糖蜜添加量均差異顯著（P＜0.05），同時從經濟因素和原料的轉化率方面考慮，糖蜜添加量選擇6%為最適。

圖2 糖蜜添加量對OD560nm值的影響Fig.2 Effect of molasses concentration on OD560nm

2.3 氮源的確定

圖3 不同氮源對OD560nm值的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on OD560nm

由圖3可知，與不添加任何氮源的對照組相比，添加量為0.10%尿素組OD560nm值顯著升高（P＜0.05），0.22%硫酸銨組OD560nm值顯著降低（P＜0.05），0.33%蛋白胨組OD560nm值雖升高但無顯著性差異（P＞0.05）。因此確定尿素為氮源。

2.4 尿素添加量的確定

圖4 尿素添加量對OD560nm值的影響Fig.4 Effect of urea concentration on OD560nm

由圖4可知，不同梯度尿素添加量的各組間吸光度值差異均不顯著（P＞0.05），由于糖蜜中的蔗糖、還原糖和棉實糖都是可以被微生物利用的碳源，但是只有部分的氮能夠被酵母利用[13]，其中的含氮量不能完全的滿足酵母菌的生長，必須添加氮源，但也無需太多，從節約成本考慮確定尿素的添加量為0.05%。

2.5 磷酸二氫鉀添加量的確定

圖5 磷酸二氫鉀添加量對OD560nm值的影響Fig.5 Effect of KH2PO4concentration on OD560nm

由圖5可知，與對照組相比，各組均無顯著性差異（P＞0.05），不同添加量組的OD560nm值均高于對照組，0.05%組增加的趨勢較明顯，而添加量為0.10%組的OD560nm值較0.01%組和0.05%組有所降低，所以磷酸二氫鉀的適宜添加量為0.05%。結果表明，適量添加磷酸二氫鉀可以促進酵母菌的生長，提供細胞生長所需要的磷和鉀，同時也起到了一定的緩沖作用，添加過量則會抑制酵母菌的生長。

2.6 酵母浸粉添加量的篩選

圖6 酵母浸粉添加量對OD560nm值的影響Fig.6 Effect of yeast extract powder addition on OD560nm

由圖6可知，與對照組相比，各組均無顯著性差異（P＞0.05），這是由于糖蜜成分復雜，除提供菌體生長所必需的碳源外，還含有其他豐富的營養物質如礦物質、維生素等[14-15]，因此糖蜜培養基中不需要添加酵母浸粉。

2.7 無機鹽添加量的篩選

由圖7可知，由于糖蜜中本身含有豐富的無機鹽，與對照組相比，各組均無顯著性差異（P＞0.05），且不同程度的抑制了酵母菌的生長，說明糖蜜培養基中不需要添加無機鹽。

2.8 釀酒酵母培養基優化正交試驗分析

在單因素試驗基礎上，選擇糖蜜添加量、尿素添加量、磷酸二氫鉀添加量3個因素進行正交試驗，正交試驗因素與水平見表1，結果與分析見表2，方差分析見表3。

圖7 無機鹽添加量對OD560nm值的影響Fig.7 Effect of inorganic salts addition on OD560nm

表1 釀酒酵母培養基配方優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for medium formula optimization ofSaccharomyces cerevisiae

表2 釀酒酵母培養基配方優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization ofSaccharomyces cerevisiae

表3 釀酒酵母培養基優化正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization ofSaccharomyces cerevisiae

由表2可知，影響釀酒酵母菌OD560nm值的主次順序為RA>RB>RC，即糖蜜添加量對酵母菌OD560nm值影響最為顯著，然后依次為尿素和磷酸二氫鉀添加量。酵母菌最優培養基組合為A3B2C2，即糖蜜8%、尿素0.05%、磷酸二氫鉀0.05%。在此最佳條件下，OD560nm值為22.364，酵母菌的干質量達到7.67g/L，比未優化培養基提高了23.3%。

由表3可知，糖蜜添加量對酵母菌OD560nm值影響顯著，尿素和磷酸二氫鉀添加量對酵母菌OD560nm值影響不顯著。

3 結論

本研究以糖蜜為碳源，實驗室分離出的釀酒酵母為試驗菌株，在單因素試驗基礎上進行正交試驗，對釀酒酵母的培養基進行優化，最終優化的培養基配方為糖蜜添加量8%，尿素添加量0.05%，磷酸二氫鉀添加量0.05%。在此最佳培養條件下，培養的酵母菌干質量達到7.67g/L，比未優化培養基條件下的酵母菌干質量提高了23.3%。

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Optimization ofSaccharomyces cerevisiaemedium with molasses as carbon source

CHEN Xue1,ZHEN Yuguo1,2*,ZHAO Xiaoli1
(1.JAU-Borui Dairy Science and Technolgy R&D Center,College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China;2.Technolgy Center of Changchun Borui Feed Co.,Ltd.,Changchun 130114,China)

Usingbeetmolassesascarbon source,based on shake flask test,on the basis of single factor experiments,orthogonal experiment was adopted to optimize the formula ofSaccharomyces cerevisiaemedium.The optimum formula was determined as follows:beet molasse 8%,urea 0.05%,monopotassium phosphate 0.05%.Under the optimized condition,the cell weight reached 7.67 g/l,which was 23.3%higher than the non-optimized one.

beet molasse;Saccharomyces cerevisiae;medium;optimization

TS261.1

A

0254-5071（2014）04-0035-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.009

2014-03-06

吉林省重大科技攻關項目資助（No.2012ZDGG006）

陳雪（1990-），女，碩士研究生，研究方向為反芻動物營養。*

甄玉國（1970-），男，副教授，博士，研究方向為反芻動物營養。