單孢分離交配法提純復(fù)壯杏鮑菇品種*

秦路寧 劉俊波 鄭雪平 劉東波 夏志蘭**

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單孢分離交配法提純復(fù)壯杏鮑菇品種*

秦路寧1劉俊波1鄭雪平2劉東波1夏志蘭1**

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.北京市正興隆生物科技有限公司，北京 昌平 102211）

通過對一個已退化的杏鮑菇品種進行單孢分離、交配，以及出菇試驗找出最能體現(xiàn)雜種優(yōu)勢的配對孢子組，恢復(fù)最初的優(yōu)良性狀。結(jié)果從該杏鮑菇子實體中分離獲得了11個單孢子；分別進行單孢交配，獲得了12個配對組合。通過篩選，對其中6個組合進行出菇試驗，內(nèi)有3個交配組的生物學(xué)效率優(yōu)于親本，表明此方法收到了對杏鮑菇菌種進行提純復(fù)壯的效果。

杏鮑菇；單孢分離；單孢交配；提純復(fù)壯

杏鮑菇[(DC.ex Fr.)Qu l.]又名刺芹側(cè)耳，其菌蓋幼期呈半球狀，色澤灰黑，成熟后菌蓋平展，色漸淡，中心部位有近放射狀黑色條紋，潔白，表面光滑；菌肉肥厚，嫩脆，具杏仁香味[1]。由于杏鮑菇是受雙因子控制的四級性異宗結(jié)合菌類，其單孢子的雜交組會有3種表現(xiàn)型，即優(yōu)質(zhì)型、穩(wěn)定型、劣質(zhì)型[2]。實驗?zāi)康脑谟谔暨x出優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的單孢交配組，以期達到提純復(fù)壯的效果。

1 試驗方法

1.1 杏鮑菇品種與來源

正興1號品種，由北京正興隆生物科技有限公司提供。

1.2 杏鮑菇孢子的收集

采集數(shù)朵約八成熟且菇蓋稍大的杏鮑菇子實體，在菇體表面用無菌水沖洗、陰干，在超凈工作臺上把子實體固定在經(jīng)滅菌的收集皿中并編號，放置于25 ℃室溫環(huán)境中培養(yǎng)5～7天[3]。待彈射出足夠的孢子后，將裝有孢子的培養(yǎng)皿密封好，放入4 ℃冰柜中低溫冷藏備用。

1.3 單孢分離的平板稀釋分離法

在超凈工作臺上，用10～100 μL的移液槍吸取少量無菌水后從培養(yǎng)皿中粘取少量孢子粉注入1號三角瓶中，攪拌均勻；換用5 mL移液槍吸取5 mL懸液注入2號三角瓶，攪拌均勻。依此步驟稀釋至第6號三角瓶，得到一組孢子懸液[4]。

依次從1至6號三角瓶中吸取少量懸液，于顯微鏡下觀察，400倍單個視野中含2～3個孢子為最佳接種液。圖1為單孢子顯微鏡形態(tài)示意圖。

圖1 單孢子

用1 mL移液槍從最佳稀釋濃度的三角瓶中吸取0.5 mL懸液加到平板PDA培養(yǎng)基上并均勻涂布，倒置遮光培養(yǎng)2～3天，溫度為25 ℃，待孢子萌發(fā)。

1.4 單核菌絲鏡檢

當(dāng)孢子萌發(fā)成肉眼可見的“小菌落”時，立即轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。新菌落萌發(fā)至直徑為3～4 cm時，置于顯微鏡下鏡檢，無鎖狀聯(lián)合的為單核菌絲。單核菌絲白色，較稀，呈匍匐狀，生長速度緩慢，平均為3.6 mm/d[5]。將各單核菌落取小塊置于新培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待其長至直徑為3～4 cm時，進行單孢交配。

1.5 單孢交配

在培養(yǎng)出的單核菌絲進行單孢交配前，按照稀釋倍數(shù)依次命名。例如，從2號三角瓶中獲得的單核菌絲，命名為2-1、2-2，以此類推。

在超凈臺上，取裝有單核菌絲的培養(yǎng)皿2個，各用接種鉤切取綠豆粒大小的菌塊先后放入一個新的平板PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，兩菌塊之間的距離以2～2.5 cm為最佳，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)室中避光培養(yǎng)。

1.6 雙核菌絲篩選

將供試菌株從保藏試管中接到PDA培養(yǎng)基上于25 ℃環(huán)境下黑暗培養(yǎng)10 d；取菌落邊緣直徑為0.6 cm的菌塊接于PDA平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，觀察菌絲生長勢及色澤。采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長速度[6]。

將鏡檢選出的雙核菌絲轉(zhuǎn)入試管中培養(yǎng)至菌絲長滿試管后，各取小塊菌塊接種至平板PDA培養(yǎng)基上測量生長速度。接種后每天觀察菌塊生長情況，記錄菌絲的直徑，以及生長時間。培養(yǎng)皿直徑為90 mm，從接種至菌絲長滿培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基為總時間，雙核菌絲生長速度＝培養(yǎng)皿直徑／總時間[7]。

1.7 交配組合出菇試驗

培養(yǎng)料配方：木屑24%，甘蔗渣23%，玉米芯23%，麥麩18%，玉米粉5%，豆粕5%，輕質(zhì)碳酸鈣1%，石灰1%，pH值9，含水量65%。

菌絲長滿袋后，進行搔菌、疏蕾、出菇管理及采收，記錄鮮菇菌柄直徑、長度、菌蓋直徑、菌總重量，以此計算杏鮑菇生物學(xué)效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 交配組合的獲得

試驗結(jié)果包括孢子稀釋分離情況、單核菌絲交配情況、雙核菌絲篩選和出菇試驗三個部分。從中篩選出菌絲生長速率最快，菇型最好和生物學(xué)效率最高的交配組。

在400倍顯微鏡下觀察得到了第5號三角瓶為最佳稀釋濃度的孢子懸液，單孢分離結(jié)果分別為：涂布培養(yǎng)皿總數(shù)18個，單孢子挑取總數(shù)13個，單核菌絲培養(yǎng)皿數(shù)11個。

由于孢子萌發(fā)需要諸多條件，包括孢子的生活力，培養(yǎng)基的營養(yǎng)水平，培養(yǎng)環(huán)境的溫度等。孢子在平板涂布后的培養(yǎng)皿上成功萌發(fā)的幾率偏低；單孢子挑取后通過鏡檢為單核菌絲的幾率很高。

單孢交配情況如表1所示。

表1 單孢交配結(jié)果

注：1）表格中填入“—”的是交配失敗的組合；2）表格中填入“×”的是重復(fù)試驗；3）表格中填入“＋”的是交配成功的組合。

表2顯示，最終單核菌絲交配后成功的組合有12個。

表2 雙核菌絲生長速度

2.2 交配組合的篩選

雙核菌絲生長速度測試結(jié)果如表2。正常培養(yǎng)條件下，杏鮑菇交配組合菌株間的菌絲日生長速度大概在8.30～10.00 mm之間[8]。本次試驗選取了日生長速度在8.0 mm及以上的雙核菌絲5-1×2、5-1×9、5-1×10、5-3×4、5-6×8、5-6×9這6個組合用作出菇試驗（表3）。

表3 交配組合與杏鮑菇1號的出菇效果比較

2.3 交配組合的出菇試驗

表3是篩選出的6個交配組合與親本原品種杏鮑菇正興1號進行比較的結(jié)果。

杏鮑菇生物學(xué)效率/%＝鮮菇總重／所用培養(yǎng)料干重×100。公式中鮮菇總重采用平均值，所用培養(yǎng)料干重每袋約420 g。從表3中可知，6個交配組合生物學(xué)效率僅5-3×4低于親本，而5-1×2、5-1×9、5-6×8三個交配組合的生物學(xué)效率明顯高于親本。

2.4 分析

單孢交配成功的組合有小部分性狀比親本差。因為單孢交配能獲得三類菌株性狀類型：優(yōu)質(zhì)型、穩(wěn)定型、劣質(zhì)型。單孢交配獲得的6個杏鮑菇交配組合在生物學(xué)效率上普遍都比親本高，說明對杏鮑菇菌株進行提純復(fù)壯是一項簡單有效的育種技術(shù)，能提升菌種質(zhì)量，提高生物學(xué)效率。單孢交配成功的幾率很低的原因是兩個同一品種分離出來的孢子交配，受親和關(guān)系及性別因素的影響。

單孢交配后獲得的交配菌株與親本是否相同，可以通過以下4個方法鑒別：一是觀察雜種菌絲有無鎖狀聯(lián)合；二是進行拮抗實驗，觀察雜種與親本有無拮抗線；三是進行DNA鑒定，觀察雜種與親本的親緣關(guān)系；四是進行出菇試驗，觀察能否結(jié)實及子實體生長狀況[9]。優(yōu)良的菌種體現(xiàn)在兩方面：一是種性好，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)，抗逆性強；二是純度高，無病蟲害感染[10]。交配組合菌絲生長速度測試和出菇試驗證明了單孢分離交配技術(shù)對提純復(fù)壯杏鮑菇退化品種的可行性和有效性。

[1] 黃年來. 18 種珍稀美味食用菌栽培[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1997: 1-157.

[2] 劉盛榮, 吳小平, 謝寶貴. 杏鮑菇的遺傳特性及種間雜交研究[J]. 微生物學(xué), 2008, 04, 01.

[3] 陳娟, 蘇開美. 食用菌育種及種質(zhì)鑒定進展[J]. 中國食用菌, 2008, 27(5): 3-8.

[4] 張昊, 張爭, 許景升, 等. 一種簡單快速的赤霉病菌單孢分離方法—平板稀釋畫線分離法[J]. 植物保護, 2008, 34(6): 134-136.

[5] 馮偉林, 蔡為明, 金群力, 等. 杏鮑菇擔(dān)孢子交配型的鑒定分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2010, 22(1): 102.

[6] 徐全飛, 郭亮, 充娜, 等. 杏鮑菇工廠化栽培優(yōu)良菌株的篩選及親緣關(guān)系評價[J]. 食用菌學(xué)報, 2010, 17(2): 19-21.

[7] 趙桂云, 暴紀(jì)春, 張晶, 等. 十四種食用菌菌絲形態(tài)觀察[J]. 食用菌, 2007, 29(2): 14-15.

[8] 姬建軍, 夏志蘭, 劉東波, 等. 杏鮑菇菌株的生物學(xué)特征及農(nóng)藝性狀比較研究[J]. 食用菌, 2011(5): 14-16.

[9] 劉宇, 耿小麗, 王守現(xiàn), 等. 杏鮑菇14號雜交菌株選育研究[J]. 中國食用菌, 2011, 30(6): 15-17.

[10] 潘崇環(huán), 馬立驗, 韓建明, 李沫. 食用菌栽培新技術(shù)圖表解[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2011: 1-3.

Purification and Rejuvenation of DegeneratedStrain by Single Spore Mating*

Qin Luning1, Liu Junbo1, Zheng Xueping2, Liu Dongbo1, Xia Zhilan1

(1.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128; 2.Peking Zheng XinglongBiotechnology Limited Company,Peking Champin 102211)

The experiment on single spore of a degradedvariety which isolation and pairing, is to identify the best monospore combination of heterosis, and restore the originally excellent characters of the variety. The experiment result expresses, 11 monospores were isolated, 12 combinations were obtained through monosporous hybridization, respectively, from the sporocarp of thisvariety. By making the mushroom experiments of 6 combinations, which prove that biological efficiency of three hybrid combination is better than parent,strains reached the effect that purification and rejuvenation with this method.

; separation of single spore; single spore hybrid; purification and rejuvenation

S646.1

A

2095-0934（2014）01-048-03

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題，食用菌新品種培育及制種關(guān)鍵技術(shù)研究（2013BAD16B02）

E-mail: 695218379@qq.com。