間充質干細胞治療周圍神經損傷的研究進展

張 杰(綜述)，肖玉周(審校)

(蚌埠醫學院第一附屬醫院骨科，安徽 蚌埠 233004)

周圍神經損傷原因有外科創傷、腫瘤切除、糖尿病足等，因其結構上的脆弱性和功能上的復雜性，所以一旦損傷就會造成支配區域的感覺運動和自主神經的功能障礙。臨床上遇到此類病例主要是采用直接縫合法、自體神經移植或異體甚至異種神經移植，但以上幾種方法的自身缺點而限制了其在臨床中的應用。隨著生物技術的發展，組織工程學應運而生，其三要素是支架、種子細胞和營養因子。種子細胞由施萬細胞到后來的基質干細胞，再到誘導的類施萬細胞。該文主要就種子細胞即施萬細胞及其前體細胞間充質干細胞的研究進展予以綜述，重點在目前還未解決的問題，以期為進一步的研究重點做鋪墊。

1 周圍神經損傷的病理生理變化

針對長段的神經缺損人們已經進行了大量的基礎研究和部分的臨床試驗，證實選擇合適的人工神經移植物對修復一定長度的神經缺損有促進作用[1]。施萬細胞是周圍神經中重要的膠質細胞。研究發現周圍神經受損后，局部發生變性，施萬細胞大量增生形成Bungner帶，并與周圍的巨噬細胞一起吞噬清除變性的軸突和髓鞘裂解物，并能分泌包括神經生長因子在內的神經營養因子[2]。雖然施萬細胞是修復周圍神經的優質種子細胞，但要將其用于組織工程還有很多困難。施萬細胞的來源主要有三個，即自體施萬細胞分離增殖、異體施萬細胞分離增殖、干細胞增殖分化。自體施萬細胞因其來源有限且會造成供區的神經缺損，異體施萬細胞因存在排斥反應而使前兩者應用受到限制。因此，研究者把目光轉向了干細胞的分離擴增分化上來。這一研究可能會使既往認為的神經組織不可修復不可再生的觀點得以改變[3]。

2 間充質干細胞的特性

間充質干細胞是存在于結締組織和器官間質中的一種具有強大的繁殖能力、多向分化潛能及免疫調節功能的來源于中胚層的細胞,是一種具有高度的自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，因其具有免疫調控、分泌細胞因子等作用而成為細胞治療的理想種子細胞[4]。在一定的誘導條件可分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和再生能力極差的神經細胞[5-6]。不僅可用于組織工程，還可為其他細胞的生長繁殖提供支持。因具有來源廣泛、易于分離提純擴增等優勢而日益成為研究熱點[7]。除此之外,間充質干細胞還有如下特性：①“歸巢”性，即像免疫細胞一樣，有向受傷或有炎癥的局部遷徙的特性；②低免疫原性，目前臨床已有大量利用間充質干細胞治療移植物抗宿主病和自身免疫病，這足以證明其免疫原性弱[8]。間充質干細胞是成體干細胞的一種，具有很高的可塑性及自我繁殖能力，主要來源于骨髓、脂肪、臍帶血、臍帶等。對間充質干細胞的鑒定及純度的測定是非常重要的,因其缺乏特異性的表面標志物，因此只能通過檢測一系列的分子指標來鑒定[9]。目前比較公認的是國際細胞療法學會制訂的標準：①體外培養具有貼壁性；②表面分子需表達CD105、CD73、CD90，不表達CD34、CD45、CD19等；③有自我更新能力及多向分化潛能[10]。

3 間充質干細胞的研究歷程及各自特點

研究最早的間充質干細胞是骨髓來源的，也是目前研究技術相對成熟的施萬細胞來源，已證實其可分化為骨、軟骨、脂肪等細胞，且免疫原性也較低。但是隨著研究的進展也發現了骨髓來源的間充質干細胞有很多不足之處，主要有取材時會對供體造成傷害或感染，隨著供者年齡的增大干細胞數量下降及增殖和分化能力會降低[11]。胚胎干細胞因涉及法律和倫理的問題而使研究受到限制。新世紀以來又有學者發現臍帶血中亦含有間充質干細胞，并有來源豐富、取材無創、增殖能力強、免疫原性弱、無倫理學爭議、無腫瘤細胞、費用低等優勢,且其治療效果不亞于骨髓來源的間充質干細胞[12-13]。有研究表明,臍血間充質干細胞可以分泌細胞因子和神經生長因子等，在疾病治療方面起重要作用[14]。但臍血來源的間充質干細胞含量少，據統計只有25%臍血的單核細胞培養出間充質干細胞，其余75%培養出破骨樣細胞[15]。臍血間充質干細胞和骨髓間充質干細胞的表面標志物區別在于臍血的CD90和CD166的表達水平高于骨髓來源的間充質干細胞，提示臍血來源的間充質干細胞的骨祖細胞含量較豐富。

4 國內外研究已取得的進展

目前多數研究者認為間充質干細胞的修復機制可能是旁分泌機制，即細胞移植入體內后大部分死亡，釋放膜微囊趨化并調節周圍細胞的功能，少數存活的細胞通過分泌大量的小分子物質發揮作用[16]。針對間充質干細胞難培養，尤其是獲取早期數量比較少的情況，現有研究發現生物反應器3D的培養模式效果比較好，因為其在相同的體積下培養的表面積比較大，系統封閉，種植和收獲可以自動化[17]。通過對細胞植入體內后的跟蹤發現一種納米粒技術，能夠抵御體內的干細胞代謝性降解，是長期跟蹤干細胞發展的一種好方法，可以探究移植物從植入到凋亡的全過程[3]。現已發現端粒酶在維持細胞染色體的穩定性方面起著重要的作用，因此研究端粒酶對檢測及預防細胞的凋亡會有一定的作用。間充質干細胞與許旺細胞在體外共培養可促進干細胞向施萬細胞的分化[18]。有研究表明，骨髓來源的施萬細胞在受損髓鞘局部有再生的能力[19]。現已證明貼壁實驗是目前檢測細胞活性較為實用的一種方法[20]。間充質干細胞用于修復周圍神經途徑主要有以下幾個方面：①直接注入受損區域；②誘導為施萬細胞后注入受損區域；③制成人工神經移植物植入受損區。有研究表明,直接注入處理后的臍帶血間充質干細胞對糖尿病足引起的周圍神經損傷的修復有促進作用[21]。組織移植安徽省重點實驗室已成功把骨髓和臍帶血間充質干細胞體外誘導為施萬細胞并進行了相關的鑒定，對誘導方法進行了優化，在動物體內模型進行了研究并證實了由臍血間充質干細胞誘導而來的施萬細胞對修復大鼠坐骨神經受損有促進作用。現在研究者已認識到分化是細胞和環境相互作用的結果，主要是通過調控基因的表達起作用。五代以內的間充質干細胞可自行分泌腺苷三磷酸分子，并可與細胞膜結合后改變膜內外電位，從而引起膜電位變化[22]。經典的Wnt通路參與了間充質干細胞的分化調控[23]。反復的微熱刺激能夠防止衰老的進展，這為其大規模的擴增增加了更多的機會。間充質干細胞的轉分化機制目前主要有三種學說，即異質性學說、核重編程學說(包括細胞融合)和胚胎干細胞殘存學說。

5 大量應用于臨床前尚需解決的問題

目前存在的不足和問題，主要分為以下幾個方面：①神經受損后修復的速度非常慢，修復后功能的恢復有待考證。②神經移植物在體內是否能降解，降解的速度是否和神經恢復的速度相適應。③運動神經的恢復速度比感覺神經快，是否會引起感覺與運動不協調。④受損后的神經恢復很難達到之前正常的水平。⑤誘導后植入體內的細胞是否殘存有誘導劑及其對體內正常細胞的毒性尚不知曉。⑥有報道稱腫瘤是間充質干細胞異常分化而來的，因此植入的細胞是否有惡變及其比例需進一步研究[24]。⑦機體局部受損后多處于相對缺氧和缺血狀態，會影響植入的施萬細胞活性的表達。⑧目前的大多實驗還處于實驗室階段，是人工模擬的環境，但真實的體內環境極其復雜，勢必會對植入物產生一定的影響。⑨周圍神經修復和功能的評價目前還沒有統一的標準，可能使不同的實驗缺乏對比性。⑩移植物移植到體內后是否穩定，有無“返祖”現象。有報道稱直接把間充質干細胞注入體內的效果優于誘導后的施萬細胞，因此誘導的必要性需要進一步研究[25]。人工神經植入體內促進神經修復的具體機制尚不清楚。有關植入體內后的遠期效果報道甚少，有無異位骨化和凋亡等形成。間充質干細胞的分離純化及擴增等方法還不夠完善。移植的時機、移植的數量、移植后存活及長期療效、移植后能否控制其增殖的速度。有報道稱間充質干細胞有腫瘤組織趨向性，但其效果是促進還是抑制腫瘤生長仍有爭議。有研究者稱間充質干細胞會誘導腫瘤細胞死亡[6]。而有的研究者則稱間充質干細胞在腫瘤的轉移過程中起著重要作用[26]。細胞移植入體內后的存活率較低且差異較大，介于0.5%～38.0%之間，可能與細胞的種類和植入的時間點有關[27]。目前比較一致的看法是十代以內的細胞基因型基本是穩定的，但隨著代數的增多其致瘤風險會增大。有研究表明植入后的細胞活性比在體外培養時要低，因此如何保持和提高細胞活性需進一步研究[28]。干細胞內的微環境由哪些成分組成，這些成分又是如何調節細胞的增值和分化的。植入體內的利與弊如何衡量。體外人工擴增后真正具有功能的間充質干細胞比例是多少。體外培養的細胞活性低，移植前細胞活性的檢測對治療效果影響非常大[29]。目前多采用椎蟲藍染色來檢測細胞的活性[30-31]。但還未獲得大范圍推廣。有報道稱在體內環境下的培養有利于類施萬細胞的增殖，但目前的實驗擴增多在體外模擬環境下進行[32]。體外培養的間充質干細胞與血清、細胞因子等直接接觸，易受熱源和內毒素的污染，有造成醫源性感染的風險。

6 小結與展望

只有將間充質干細胞分化誘導、作用的具體機制、分化細胞表型、能否分泌神經遞質及量的多少等問題研究清楚后，才能進一步應用于臨床[33]。許多組織中間充質干細胞含量較少，因此想在臨床上應用必須在體外進行大量的擴增。體外擴增是在人工環境下進行的，擴增后的細胞就可能與從組織中新提取的在生物學方面有所區別，可能會造成醫源性的不良反應[34]。間充質干細胞分化需要人工的調控，分化后細胞的純度值得商榷。衰老是所有有機體的共同特征，干細胞也不例外，因此建立檢測衰老的程度和比例的系統和防止或延緩衰老進展非常重要。有研究稱體外培養嚴重影響植入性，植入的細胞最終要被受體自身的細胞所替代[16]。在應用于臨床之前，移植的成本、安全性，移植后的有效檢測是急需解決的問題[35]。

相信隨著生物科學技術的發展，以上提到的問題與不足會逐一解決，間充質干細胞的眾多優勢定能發揮出來，給人們的未來帶來新的希望，周圍神經損傷的修復一定會取得突破性進展。

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