表皮生長因子的基礎研究及在耳鼻咽喉科中的臨床應用

唐 強(綜述)，阮 標(審校)

(1.重慶市合川區人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科，重慶 401520； 2.昆明醫科大學第一附屬醫院耳鼻咽喉科，昆明 650031)

1962年，Cohen[1]【Cohen,1962 #1801】在純化小鼠頜下腺神經生長因子時發現一種可促進新生小鼠開瞼、長牙的蛋白質,稱為牙-眼瞼因子,隨后將這一種活性成分加入培養的表皮時發現可直接促進表皮的生長，定名為表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)。1975年,Gregory[2]將其確認為人表皮生長因子。EGF是一類廣泛存在于人和動物體內、可促進或抑制多類細胞生長的多肽，由53個氨基酸殘基組成，相對分子質量為6×103左右。天然的EGF在人和動物的體內甚微，難以大量制備供應于臨床，20世紀80年代以來，通過基因重組技術，人類已成功地生產出高純度且活性和天然產物高度一致的重組人表皮生長因子(recombinant human epidernal growth factor,rhEGF)。目前，rhEGF已廣泛用于臨床。

1 EGF的生物學和生理學

1.1EGF的生物學

1.1.1EGF的分子結構及其功能 EGF的分子結構及其功能的研究是近年來發展較迅速的領域之一。在EGF的一級結構研究方面，已通過氨基酸順序測定獲得了一系列關于人、小鼠、大鼠和豚鼠等來源的EGF有關資料。各類來源的EGF均具有一個同源核心序列，這一核心序列長度為36～40個氨基酸殘基，其中包括6個組成3個二硫鍵的半胱氨酸殘基[3]。大鼠EGF(rEGF)的cDNA分析結果表明，EGF前體的C端含有一個Trp-Trp-Asn-Trp-Arg-His-(x)n序列，在Arg-His間經胰蛋白酶內切后即可產生相對分子質量和C端順序類似人表皮生長因子(human epidernal growth factor，hEGF)和小鼠EGF、含53個氨基酸殘基的多肽。正是由于核心序列和C端包含胰蛋白酶專一作用位點，使得各類來源EGF在一級結構上具有高度的同源性。一系列的點突變、片段合成、化學修飾及兩個末端切除和共價連接研究結果表明，EGF的生物學活性主要由上述核心序列決定，第23位的異亮氨酸、第37位的酪氨酸及第47位的亮氨酸殘基對EGF的活性影響亦較大[4]。N端的第一個半胱氨酸殘基以前的序列缺損和共價連接及C端1～3氨基酸殘基的缺損均對EGF活性的影響不大。因此，在自然界存在多類分子大小不一但仍具有相似生物活性的EGF序列。

1.1.2EGF的理化特性 各類來源的EGF均為耐熱耐酸的多肽，其等電點為酸性，是最穩定的蛋白質之一。

1.1.3EGF受體及其與EGF的結合反應 EGF受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的研究亦是近年來較為活躍的領域之一。EGFR首先在20世紀80年代初期從人皮膚癌細胞株A-431中分離出，在該細胞株中EGFR過度表達20～50倍。EGFR為相對分子質量170×103的膜嵌糖蛋白，含有EGF的高親和力專一結合位點，與受EGF激活的酪氨酸蛋白激酶在近細胞質端緊密相連，并具有一個腺苷三磷酸結合位點。

EGF與EGFR結合后可誘導受體酪氨酸激酶活性，迅速增加磷酸脂酶C及酪蛋白激酶Ⅱ的活性改變，并可激活一系列重要基因[5]。在這些基因中，一類是可直接調控或誘導細胞增殖的基因，另一類是調節生長的基因。前類受EGF激活的基因對于細胞增殖的啟動和調控具有重要意義，EGF可刺激此類基因迅速轉錄,這類基因包括：葡糖轉運蛋白基因，編碼“Zinc-finger”阻斷轉錄因子的Knox-24基因、核抗原Cyclin基因、編碼S100類阻斷鈣結合蛋白的Calcyclin基因、α-肌動蛋白基因、編碼Ap-1(activator protein-1)類轉錄因子的c-Jun基因及c-Fos和c-myc基因。EGF對編碼轉錄因子的激活可刺激總的信使RNA的合成和激活上述第二類基因，但激活效果來得較慢，且這種激活與蛋白質的合成有關。EGF刺激合成的蛋白質包括：糖酵解酶、分泌金屬蛋白酶的運載蛋白、血纖維蛋白溶酶激活因子、鳥氨酸脫羧酶、腺苷二磷酸/腺苷三磷酸載體蛋白及細胞附著因子等，這些蛋白在生長的調控方面均起著重要作用[6-7]。因此，EGF與其受體的結合反應可激活直接參與啟動和調控細胞增殖的基因及編碼與生長調節有關的重要蛋白的基因。

1.2EGF的生理學功能 小鼠中存在EGF信使RNA的部位或組織有頜下腺、腎、肝、口腔、乳腺、胰腺、十二指腸、腦垂體、肺、脾、腦、淚腺等。靈敏的放射免疫分析技術現已探明，hEGF幾乎遍布人體所有體液，唾液和尿液中hEGF的平均含量分別為9.2×103ng/L和8×103ng/L，而血液中只有(0.2×103～1.5×103) ng/L，因此EGF不是循環激素。

由于EGF廣泛分布于體內，而多類表皮細胞群對EGF的刺激能作出靈敏的反應，且EGF為這些表皮的高度更新所必需。因此,在理論上EGF在活體內亦參與同樣的生理反應。外源性EGF給藥實驗可產生廣泛的生理學反應。對于胃腸道來說，EGF主要起著保護細胞、促進潰瘍愈合及抑制胃液分泌的作用。在口腔中，EGF可以刺激口腔黏膜的生長和分化。EGF對角膜的損傷亦有促進修復的作用。Kim等[8]報道濃度為5 g/L的EGF即可刺激兔角膜燒傷模型的上皮細胞的增殖而加快角膜創面的修復。

2 EGF與體表創面愈合

McCarthy等[9]應用免疫組織化學法研究兒童燒傷患者的深Ⅱ度創面滲液發現，在創面再生皮島中及其邊緣，以及汗腺導管及附近均可見HB-EGF(heparin-binding EGF)。這種HB-EGF的非正常性分布表明EGF在創面修復中發揮作用，提示傷后創緣表面有反應性的EGF沉積及再分布。因此，理論上完全可以通過EGF刺激細胞增殖、組織增生和重要胞間基質的合成來促進各類創面的愈合。Andree等[10]研究發現，被hEGF轉染后培養的人成纖維細胞被移植到大鼠深Ⅱ度燒傷創面上較對照組在7 d內擴增了180倍，明顯加快創面的愈合時間。Cribbs等[11]外用EGF于深Ⅱ度燒傷創面時發現，創面愈合時間較對照組顯著縮短。付小兵等[12]對人體慢性創面外用EGF進行免疫組織化學研究發現，EGF治療8 d的創面表皮干細胞與短暫擴充細胞不僅數量多，而且體積增大，治療14 d后的創面再生表皮的棘細胞層中有“干細胞島”出現，未經EGF治療組治療8 d與14 d創面未見干細胞出現，結果提示，EGF促進皮膚再生的主要機制之一可能與其誘導皮膚干細胞快速定向分化有關。EGF的促進創面愈合作用無論在動物還是人體效果均是明顯的。

3 EGF在耳鼻咽喉科疾病中的臨床應用

3.1EGF與鼓膜穿孔的愈合 O′Daniel等[13]用EGF治療貓急性創傷性鼓膜穿孔的愈合率為93%。Chauvin等[14]將EGF和透明質酸用于治療豬慢性鼓膜穿孔，治愈率為100%。Mondain等[15]用免疫組織化學定位法發現豚鼠鼓膜創傷性穿孔后EGF表達，穿孔3 d表達達到高峰，5 d開始下降，說明EGF參與鼓膜修復調控。段文彬等[16]觀察EGF對豚鼠鼓膜穿孔的作用時發現，實驗組50例中2周內77.8%鼓膜穿孔愈合，對照組50例中僅36.4%愈合，12周實驗組治愈率為91.7%，對照組為75%，該實驗觀察EGF組除上皮細胞增生外，纖維層血管也明顯增生，從而促進鼓膜上皮增生，這是實驗組較對照組愈合率高和愈合快的原因，通過掃描電鏡觀察EGF組，內耳毛細胞無損傷，聽性腦干反應及眼球震顫電流描記檢查治療前后也無明顯改變，證明對內耳功能無明顯不良反應。熊觀霞等[17]亦發現rhEGF能促進創傷鼓膜的組織修復,且rhEGF局部應用于創傷鼓膜后,在短期內不會引起組織鈣化、瘢痕增生。龍海珊等[18]使用rhEGF明膠海綿貼補治療人外傷性鼓膜穿孔，依穿孔部位及形態分為前下、下半、后半和后下4組，發現治療組較對照組愈合時間(4周內)分別提前7.5、7.6、12.2、12.6 d未見明顯不良反應。崔萬明等[19]在外傷性中等鼓膜穿孔和大穿孔中應用rhEGF或rhEGF與貼膜聯合應用,可以顯著地縮短愈合時間,并減輕鼓膜瘢痕,提高治愈率。林刃輿等[20]亦發現EGF有明顯促進鼓膜穿孔愈合的能力，此外EGFR在鼓膜穿孔部位鄰近皮膚中等表達,表明使用表皮生長因子治療有誘發中耳膽脂瘤的風險。

3.2EGF與鼻竇炎

3.2.1EGF與慢性鼻竇炎 姜振東等[22]研究EGF在慢性鼻竇炎患者竇口鼻道復合體區域黏膜表達中發現，EGF在鼻竇炎Ⅰ型與Ⅱ型病變竇黏膜中的假復層纖維柱狀細胞、增生的杯狀細胞以及黏膜下炎性細胞與正常對照相比較有較強的表達，Ⅰ型與Ⅱ型之間無明顯差異。EGF在慢性鼻竇炎病變黏膜的過度表達可能是慢性鼻竇炎病因與黏膜病理改變的重要原因。姜振東等[22]和丁國強[23]研究發現，EGF和EGFR在慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻竇黏膜中均有明顯表達，EGFR信號通路可能在慢性鼻竇炎的病理機制中發揮重要作用。

Hansson等[24]研究認為，人鼻黏膜受到損傷后，再生的細胞胞質中EGF水平明顯增加，這表明EGF參與了鼻竇黏膜創面修復。姜振東等[22]發現，EGF、EGFR在鼻竇內鏡術后術腔的表達是一個動態的過程，EGF、EGFR在術腔的表達，一方面可能促進術腔創傷愈合，另一方面EGF、EGFR在術腔的過度表達可能與術腔囊泡、肉芽以及纖維結締組織的增生有密切的聯系。王鵬舉等[25]亦發現慢性鼻竇炎患者術后血液中的EGF開始降低，術后4周左右降到最低水平，與術前相比差異有統計學意義，6周后血液中的EGF水平逐漸升高，8周后接近正常水平，術后血液中EGF的變化模式與鼻內鏡術后黏膜的轉歸以及創面修復過程一致，進一步說明EGF在鼻內鏡術后黏膜創面修復過程中具有重要作用。

王豐等[26]將rhEGF用于鼻內鏡術后術腔換藥，發現用rhEGF側鼻腔黏膜水腫反應較輕，上皮化快，完全上皮化時間為5～7周，患者疼痛癥狀輕，分泌物較少；而生理鹽水組則完全上皮化時間為6～8周，患者疼痛癥狀重，黏膜水腫較重，分泌物較多。說明rhEGF能促進術腔上皮化，縮短上皮化的時間。林潮楷等[27]對120例Ⅱ型鼻竇炎患者術后使用rhEGF噴灑術腔，臨床觀察發現，rhEGF能有效地促進鼻竇炎術腔創面早日上皮化，縮短治愈時間。

3.2.2EGF與慢性萎縮性鼻炎 尤景敏等[28]將EGF應用于萎縮性鼻炎的治療，觀察組治療后鼻腔黏膜紅潤，痂皮消失，嗅覺改善，自覺頭痛、頭昏、鼻腔干痛癥狀消失，觀察組的有效率遠高于對照組，觀察組與對照組間差異有統計學意義。提示，應用EGF治療萎縮性鼻炎較復方薄荷滴鼻劑方法效果有明顯的提高。

4 小 結

EGF發現和研究已有50余年歷史，生物學效應及生理學功能決定了其廣泛的應用。EGF是促生長因子，它的缺乏或過度表達，均會破壞組織細胞增殖凋亡的動態平衡，造成疾病的發生，目前已發現EGF在頭頸部腫瘤的發生、發展中起重要作用，針對EGF的靶向治療可以成為今后頭頸腫瘤治療的新方向。由于EGF能促進黏膜和上皮修復，能加快耳鼻咽喉手術后的術腔上皮化，隨著對EGF研究的深入，EGF必將在臨床應用與生命科學研究中占據重要的地位。

[1] COHEN S.Isolation of a mouse submaxillary gland protein accelerating incisor eruption and eyelid opening in the new-born animal[J].J Biol Chem,1962,237:1555-1562.

[2] Gregory H.Isolation and structure of urogastrone and its relationship to epidermal growth factor[J].Nature,1975,257(5524):325-327.

[3] Yamada M,Ikeuchi T,Hatanaka H.The neurotrophic action and signalling of epidermal growth factor[J].Prog Neurobiol,1997,51(1):19-37.

[4] Savage CR Jr,Hash JH,Cohen S.Epidermal growth factor.Location of disulfide bonds[J].J Biol Chem,1973,248(22):7669-7672.

[5] Pawson T.Protein modules and signalling networks[J].Nature,1995,373(6515):573-580.

[6] Peus D,Hamacher L,Pittelkow MR.EGF-receptor tyrosine kinase inhibition induces keratinocyte growth arrest and terminal differentiation[J].J Invest Dermatol,1997,109(6):751-756.

[7] Habib AA,Chun SJ,Neel BG,etal.Increased expression of epidermal growth factor receptor induces sequestration of extracellular signal-related kinases and selective attenuation of specific epidermal growth factor-mediated signal transduction pathways[J].Mol Cancer Res,2003,1(3):219-233.

[8] Kim MJ,Jun RM,Kim WK,etal.Optimal concentration of human epidermal growth factor (hEGF) for epithelial healing in experimental corneal alkali wounds[J].Curr Eye Res,2001,22(4):272-279.

[9] McCarthy DW,Downing MT,Brigstock DR,etal.Production of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF) at sites of thermal injury in pediatric patients[J].J Invest Dermatol,1996,106(1):49-56.

[10] Andree C,Voigt M,Wenger A,etal.Plasmid gene delivery to human keratinocytes through a fibrin-mediated transfection system[J].Tissue Eng,2001,7(6):757-766.

[11] Cribbs RK,Luquette MH,Besner GE.Acceleration of partial-thickness burn wound healing with topical application of heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF)[J].J Burn Care Rehabil,1998,19(2):95-101.

[12] 付小兵,孫曉慶,孫同柱,等.表皮細胞生長因子通過誘導皮膚干細胞分化加速受創表皮再生的研究[J].中國修復重建外科雜志,2002,16(1):31-35.

[13] O′Daniel TG,Petitjean M,Jones SC,etal.Epidermal growth factor binding and action on tympanic membranes[J].Ann Otol Rhinol Laryngol,1990,99(1):80-84.

[14] Chauvin K,Bratton C,Parkins C.Healing large tympanic membrane perforations using hyaluronic acid,basic fibroblast growth factor,and epidermal growth factor[J].Otolaryngol Head Neck Surg,1999,121(1):43-47.

[15] Mondain M,Ryan A.Epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor are induced in guinea-pig tympanic membrane following traumatic perforation[J].Acta Otolaryngol,1995,115(1):50-54.

[16] 段文彬,陳文弦,崔鵬程,等.表皮生長因子對鼓膜穿孔愈合作用與內耳功能影響的研究[J].現代康復,2001,5(19):56-57.

[17] 熊觀霞,雷文斌,李揚,等.人重組表皮生長因子促進鼓膜創傷愈合的動物實驗研究[J].聽力學及言語疾病雜志,2006,14(3):216-218.

[18] 龍海珊,戴海江,周蕓,等.重組表皮生長因子治療外傷性鼓膜穿孔的臨床觀察[J].耳鼻咽喉-頭頸外科,2004,11(2):83-86.

[19] 崔萬明,卞英偉,高晗,等.rhEGF在外傷性鼓膜穿孔治療過程中的應用[J].大連醫科大學學報,2007,29(5):473-476.

[20] 杜曉燕,林刃輿.表皮生長因子及其受體在中耳慢性鼓膜穿孔病變中的作用[J].中華耳鼻咽喉科雜志,2004,39(11):669-671.

[21] 姜振東,張學淵.表皮生長因子在慢性鼻竇炎竇黏膜中的表達[J].重慶醫學,2003,32(11):1460-1462.

[22] 姜振東.EGF及EGFR在鼻內窺鏡術腔轉歸過程中的表達[D].重慶：第三軍醫大學,2004.

[23] 丁國強,鄭春泉.慢性鼻竇炎鼻竇黏膜中表皮生長因子及其受體的表達[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科,2007,14(4):219-222.

[24] Hansson HA,J?rgensen F,Petruson B,etal.Regenerating human nasal mucosa cells express peptide growth factors[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,1991,117(12):1368-1377.

[25] 王鵬舉,沈瑩.慢性鼻竇炎患者手術前后血清表皮生長因子含量的變化[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2011,25(2):49-50.

[26] 王豐,董瑞英,劉達根,等.重組人表皮細胞生長因子對鼻內窺鏡術后鼻黏膜生長的作用[J].感染、炎癥、修復，2003,4(4):239-240.

[27] 林潮楷,林輝龍.重組人表皮生長因子促進鼻內鏡術后術腔上皮化[J].中國中西醫結合耳鼻咽喉科雜志,2003,11(6):275-276.

[28] 尤景敏,汪建,彭華,等.表皮生長因子治療萎縮性鼻炎的效果觀察[J].廣東醫學,2003,24(10):1057.