代謝組學分析方法在2型糖尿病中的應用研究

肖 繼(綜述)，閆衛利(審校)

(天津中醫藥大學第二附屬醫院檢驗科，天津 300150)

隨著現代科學技術的不斷創新和發展，基因組學、轉錄組學和蛋白質組學等都在生命的探究中取得了重要突破。代謝組學著重于分析相對分子質量<1000的小分子代謝物質[1]，在后基因組時代的生命科學研究中發揮著重要作用。代謝組學是以物理學基本原理為基礎的分析化學、以數學計算與建模為基礎的化學計量學和以生物化學為基礎的生命科學等多學科交叉的一門新學科，它能對生物系統因病理生理或基因改變等刺激所致動態多參數代謝應答的定量測定，是關于生物體內源性代謝物質的整體及其變化規律的科學。代謝組學的中心任務包括檢測、量化和編錄生物內源性代謝物質的整體及其變化規律，并且通過這種變化規律探究所發生的生物學事件或過程的本質。它是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后新近發展起來的一門學科，是系統生物學[2]重要的組成部分。

1 代謝組學分析方法

當前代謝組學研究的核心技術是磁共振技術和質譜技術。現有的分析方法基本上可以歸為三類：磁共振波譜法、色譜-質譜聯用方法和色譜-核磁-質譜聯用法。

1.1磁共振波譜法 磁共振波譜法(nuclear magnetic resonance，NMR)是利用原子核磁特性的一種波譜分析技術，分析分子內個官能團的連接結構和化學特性。磁共振技術具有明顯的優勢：①沒有偏性，對樣品中所有的物質靈敏度是一樣的，而質譜存在離子化程度和基質干擾等問題；②具有無損傷性，可探測化合物內部結構而不破壞樣品，樣品不需要繁瑣處理，可在接近生理條件下進行實驗，因而便于活體、原位的動態檢測；③可以進行實時和動態的檢測，可設計多種編輯手段，實驗方法靈活多樣。NMR氫譜的譜峰與樣品中各化合物的氫原子是一一對應的，所測樣品中的每一個氫原子在圖譜中都有其相關的譜峰，圖譜中信號的相對強弱反映樣品中各組分的相對含量。因此，NMR方法很適合研究代謝產物中的復雜成分。但它的缺點是檢測靈敏度相對較低，很難同時測定生物體系中共存的濃度相差較大的代謝產物。

1.2色譜-質譜聯用方法 色譜-質譜聯用方法 (1iquid chromatography-mass spectrometre，LC-MS)技術已發展成為代謝組學研究的主流技術手段[3]，色譜分析是通過兩相及兩相的相對運動對分析物進行分離和分析的一種方法。質譜分析是先將物質離子化，按離子的質荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強度而實現分析目的的一種分析方法。色質聯用法將色譜儀的分離技術和質譜儀的定性定量鑒定技術相結合，是分離和鑒定同時進行，總體來說具有良好的客觀性和分辨率，但該方法屬于有偏向的選擇性檢測方法，需要對樣品有介入性和破壞性而不利于在體和原位分析；需要對樣品進行較為復雜的制備而且通量有限；對代謝組中各代謝物的原位定量十分繁瑣，未知代謝物的定性(結構確定)有相當的難度。

1.3色譜-核磁-質譜聯儀法 該方法以LC-MS和NMR為分析手段，對分析物進行平行動態分析，獲取同一成分內在相關且互補的譜學信息，可實現復雜混合物體系組分群無需完全分離的同步分析鑒定[4]。

與構成核酸的4種堿基和構成蛋白質的20多種氨基酸不同，小分子代謝物的結構種類繁多，理化性質差異巨大，含量極微且動態范圍極寬(7～9數量級)，時空分布的差異明顯，相互作用方式復雜，無論定性、定量還是動態追蹤，目前尚無完善的代謝物擴增技術和分析平臺，因此多種分析平臺方法的聯合應用能夠對代謝物進行全面的分析和了解。

2型糖尿病主要是由于胰島素抵抗、胰島β細胞功能衰竭和胰島素分泌障礙等因素引起機體代謝異常，出現葡萄糖、脂肪和蛋白質等代謝紊亂，代謝組學的應用有助于對于糖尿病的具體病因和發病機制進一步了解。

2 代謝組學在葡萄糖代謝機制的研究

2.1在動物模型的研究 遺傳易患性、環境因素、精神壓力、胰島素抵抗、生活方式等都與糖尿病的發病有關，但確切的發病機制仍未明了。而利用糖尿病動物模型進行代謝物分析將有利于針對性的病因與發病機制研究。目前，國內外糖尿病動物模型主要分為實驗性糖尿病動物模型、自發性糖尿病模型等。鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)可以通過自由基損傷β細胞，使β細胞功能受損，胰島素合成減少，引發糖尿病。小鼠多次小劑量注射STZ，可引發胰腺炎,制成免疫1型糖尿病模型,STZ可能通過細胞介導的自身免疫，更接近人類的1型糖尿病的發生、發展變化[5]。自發性動物模型是通過特定的改變動物生存條件，誘導動物自然發病，與人類某種疾病的發生、發展過程有相似之處。Fearnside等[6]通過對飲食誘導和遺傳基因型的糖尿病動物模型的對比發現，飲食誘導的動物模型更能反映胰島素抵抗的發生和糖尿病發病進程。Xu等[7]以瘦素受體基因剔除小鼠為糖尿病模型，取其肝左葉和腎皮質后行高分辨率魔角旋壓NMR檢測和代謝組學分析，結果顯示，8周齡動物模型的肝組織代謝物變化顯著，其中三酰甘油和膽汁酸升高明顯，三甲胺-N-氧化物、磷酸膽堿、甘油磷酸膽堿及膽堿明顯降低，但腎皮質未見顯著不同。Shear等[8]通過對高脂肪喂養和正常喂養的實驗鼠代謝物核磁共振氫譜分析，結果顯示高脂肪喂養的白鼠的檸檬酸鹽高于正常白鼠，而甘氨酸、賴氨酸、辛二酸鹽、醋酸鹽、亮氨酸、纈氨酸明顯低于正常白鼠。此外，賴氨酸、甘氨酸、檸檬酸鹽、亮氨酸、辛二酸鹽等降低可能是胰島素抵抗的潛在生物標志物。Lin等[9]在對高糖飼養和正常飼養的倉鼠進行口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)后，進行肝臟、骨骼肌和腦組織的MS代謝物分析，發現胰島素與溶血磷脂膽堿的正向調節有關；高糖飲食能夠增加肝臟和骨骼肌中的氧化應激，增高氨基酸的水平和改變脂肪酸生物合成，并且與大腦皮質和海馬體中氨基酸水平和嘌呤生物合成的正向調節的降低有關。

2.2在糖代謝途徑中的研究 OGTT是目前公認的診斷糖尿病的金標準，通過在空腹狀態下的高糖刺激，檢測機體對葡萄糖的代謝能力。Shaham等[10]研究發現，在OGTT正常人群中，餐后30 min后血漿中甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、牛磺鵝脫氧膽酸顯著升高，機體在攝入葡萄糖后，膽囊收縮增強，膽汁酸分泌增多，同時膽固醇7α-羥化酶mRNA的表達也增強，膽固醇7α-羥化酶基因編碼膽固醇代謝過程中重要的限速酶即膽汁酸膽固醇7α-羥化酶。葡萄糖和胰島素對膽固醇7α-羥化酶的表達提示膽汁酸代謝與葡萄糖的動態平衡存在著重要關聯性[11]。Zhao等[12]對代謝物的研究發現，糖耐量受損人群血漿中甘氨鵝脫氧膽酸的水平高于正常人群。Kondo等[13]通過給予2型糖尿病患者膽汁酸相關治療后，發現葡萄糖和糖化血紅蛋白均有所減低。目前普遍認為脂質代謝異常所導致的脂肪異常分布，過度堆積是胰島素抵抗的主要原因[14]。Li等[15]利用氣相色譜/飛行時間質譜分析技術研究糖尿病患者和正常人的血漿，發現了葡萄糖等5種生物標志物，并提出以非酯化脂肪酸增多為標志的脂肪酸代謝異常可能是糖尿病的主要病因。Matsuzaka等[16]研究小組報道，長鏈脂肪酸家族Elovl6(elongation of long chain fatty acids family member-6)是一種用來催化軟脂酸(C16∶0)轉化成硬脂酸(C18∶0)的長鏈脂肪酸延長酶，在胰島素的抵抗中扮演著重要角色。他們的實驗結果表明，由軟脂酸轉化成硬脂酸的過程與胰島素抵抗的發生息息相關。Yang等[17]借助代謝組學方法，通過對血清脂類代謝產物的分析,很好地實現了糖尿病患者與健康對照人群的分離，為糖尿病診斷提供了新的途徑。

3 代謝組學在臨床糖尿病藥物機制中的研究

3.1西醫藥機制研究 臨床上根據胰島素發病機制，治療糖尿病的藥物分為胰島素及其類似物、雙胍類藥物、磺酰脲類藥物、α葡萄糖甘酶抑制劑等。盡管治療糖尿病的藥物很多，但其作用機制不同，藥效和不良反應也不盡相同。代謝組學能夠鑒定出患者用藥后小分子物質生物化學變化，從多種代謝通路出發，構建藥物與機體代謝途徑及病理生理變化的關系，在藥效評價中充當著重要角色。劉躍芹等[18]利用超高效液相-質譜聯用(UPLC-MS/MS)方法對阿卡波糖治療2型糖尿病的藥效進行代謝組學分研究，并對衍生化后的尿液進行了代謝輪廓分析，推斷出阿卡波糖除具有α葡萄糖苷酶抑制劑的作用外，還能對體內的能量代謝通路、信號轉導相關通路及腸道菌群代謝通路途徑產生影響。

Huo等[19]研究了2型糖尿病患者服用二甲雙胍后血清中內源性代謝物的變化，篩選出苯丙氨酸和乳酸等生物標志物。Bao等[20]利用基于氣相色譜-質譜技術的代謝組學方法，分析了2型糖尿病患者服用瑞格列奈、二甲雙胍、羅格列酮之后血清代謝水平的變化，結果發現服用這三種降糖藥的患者都能顯著下調血清中谷氨酸鹽的水平，羅格列酮治療組能夠將更多異常代謝的化合物調到正常水平，提示羅格列酮治療2型糖尿較其他兩者更有效。

3.2中醫藥機制研究 中醫藥治療糖尿病及其并發癥具有悠久歷史和不可替代的優勢。中醫學認為人是一個有機的整體。構成人體的各個組成部分之間在結構上不可分割，在功能上相互協調，在病理上相互影響。但由于中藥成分復雜以及用藥方式多樣，顯然僅以中醫理論進行其藥理的機制闡述已經不能滿足現代科學對疾病治療的要求，也限制了中醫藥的自身發展。代謝組學通過對研究對象進行高通量的分析，以“代謝指紋圖譜”變化闡明中藥有效成分和作用靶標，從而真正闡明中藥的作用機制。王靜等[21]采用氣相色譜-質譜技術研究黃連治療2型糖尿病的機制，結果表明黃連不僅具有降糖和降血脂的作用，而且具有抗氧化作用。GU等[22]應用代謝組學技術考察了小檗堿治療2型糖尿病的潛在機制，結果顯示，給藥后糖尿病志愿者組血清中13種非酯化脂肪酸水平減少，其中10種有統計學意義，提示小檗堿可能是通過下調高水平的非酯化脂肪酸來發揮其治療作用。

4 小 結

目前，代謝組學作為一門多學科交叉的新學科，其檢測技術、實驗性研究及臨床應用中均取得了一定進展。但是研究平臺間存在的差異以及生物標本的復雜性和現階段分析技術的局限性，制約人們能從標本中分析出代謝物的程度，從而限制了代謝組學的發展。如何通過多分析平臺的互補作用與其他組學結合，充分利用代謝組學的優勢全面理解疾病的精確生物學過程仍需要不斷探索。

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