生長分化因子5調控細胞分化機制研究新進展

張文婷(綜述)，羅飛宏(審校)

(復旦大學附屬兒科醫院內分泌遺傳代謝科，上海 201102)

生長分化因子5(growth differentiation factor-5,GDF-5)，又稱骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)14或軟骨衍生蛋白1，是1994年發現的一種生長因子，其基因由H?tten等[1]從人的cDNA庫中首次克隆得到。GDF-5作為胚胎發育、細胞分化、機體軟骨形成、骨骼發育等的重要調節因子，近年來受到廣泛關注與研究。該文就其作用機制及潛在的作用途徑予以綜述。

1 GDF-5家族與轉化生長因子β超家族

GDF-5隸屬轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族，TGF-β家族是一類具有保守結構的二聚體蛋白，含近30個分泌信號分子，已發現9個亞族，另有BMP-2亞族、BMP-5亞族、Vg1亞族、BMP-3亞族、中間成員、活性素亞族、TGF-β亞族和“遠房”成員等，共27類因子[2-3]。它們在結構和功能上既有相同點又有不同的特征，主要介導組織的正常生長、發育，包括細胞分化、增殖、遷移和死亡。根據結構和功能指標將其分為三類：TGF-β、激活素、骨形成蛋白。一些分子還可以再分成亞家族[4]，生物活性包括：①作用于早期胚胎使之形成相應組織結構；②刺激形成軟骨，骨和性器官；③通過增強血纖溶酶原的催化活性誘導血管形成；④抑制上皮生長；⑤調節重要免疫和內分泌功能；⑥傷口修復等。

2 GDF-5的結構

GDF-5基因定位于20q11.2染色體，全長488 kb，共含有501個氨基酸，包括N端的信號肽，中間的前體肽和C端的成熟肽。翻譯后的前體蛋白裂解成為成熟肽，成熟肽發揮生物活性作用，成熟的GDF-5蛋白含120個氨基酸殘基，以二聚體形式存在。其成熟蛋白的四級結構主要由7個鏈間二硫鍵維持，半胱氨酸殘基在決定結構和功能方面至關重要。7個半胱氨酸殘基中的任何一個被絲氨酸替代，都可使GDF-5活性顯著降低[5]。

3 GDF-5作用機制

GDF-5 mRNA表達主要集中在胚胎軟骨間充質細胞聚集區、長骨發育的軟骨核以及即將形成關節的區域[6]。在軟骨發育初期，GDF-5分泌于肢體骨間質區從而募集軟骨前體細胞并促進其分化，之后GDF-5在即將形成關節的區域表達[7]。GDF-5與BMPⅠ型受體及Ⅱ型受體結合，組裝成預成型復合體或者BMP介導的信號通路復合體[8-9]。通過形成預成型復合體，BMPⅡ型受體、BMPⅠ型受體A/B亞型受體依次磷酸化而活化，繼而作用于R-Smads(Smad1/5/8)使其活化，活化的R-Smads同Smad4形成雜聚肽復合體并進入細胞核特定的DNA區域誘導目的基因的轉錄。除此之外，GDF-5可以與高親和力的Ⅰ型受體先行結合，再募集低親和力的Ⅱ型受體形成BMP介導的信號通路復合體，從而啟動不需Smads介導的信號轉導，如GDF-5可以通過誘導p38絲裂原活化蛋白激酶的信號轉導通路[10-11]。

4 GDF-5與骨修復

GDF-5與富含Ⅰ型膠原組織(如皮質骨)的結構、功能關系密切，GDF-5Bp-J/+鼠在關節炎模型中表現出明顯的膠原纖維排列紊亂[12]。GDF-5缺乏的短肢BP小鼠的骨折修復存在1～2周的延遲[13]。

Park等[14]在10只比格犬的兩邊下顎第2和第4前磨牙周圍做出4 mm×5 mm(寬×長)標準大小的深入骨質的缺損，并將它們隨機分成兩組：一組使用高劑量的人重組GDF-5聚乙丙交酯(poly-lactide-co-glycolide-acid,PLGA)載體(188 μg/缺損)填充與不作填充對照(5只)；另一組進行使用低劑量的重組人生長分化因子5(recombinant human growth differentiation factor5,rhGDF-5)PLGA載體(37 μg/缺損)填充與不含rhGDF-5的載體填充對照。24周后進行免疫組織化學分析得出臨床愈合狀態不一致，高劑量的rhGDF-5顯著增加了骨的形成，促進再生骨的成熟，并且沒有異常愈合狀況的發生。Leknes等[15]也發現含rhGDF-5的鈦移植物可以大幅度提高礦化組織的形成，這種作用與劑量呈正比。

5 GDF-5與軟骨生成

Cho等[16]發現在大鼠脛骨骨折的修復過程中，GDF-5僅在第7～14天時表達，并在第7天出現峰值表達，此時正是骨折修復過程的軟骨形成期。Coleman等[17]也指出在剔除GDF-5的小鼠的長骨修復過程中，早期骨修復過程存在明顯延遲，而骨修復早期是軟骨細胞的形成與重構時期。另有報道指出，GDF-5在骨骼發育初期主要是促進軟骨祖細胞在一定部位聚集、黏附，后期則能刺激軟骨細胞增生、肥大[18]。

Bobacz等[19]在研究腫瘤壞死因子α介導的慢性關節炎模型小鼠時發現，與野生型小鼠相比，轉基因鼠在關節軟骨區GDF-5和BMP-7的表達下降，軟骨細胞對生長因子的應答也呈下降態勢，這種下調妨害了組織的修復，同時在滑膜區GDF-5和BMP-7的表達上調，導致了關節滑液囊的肥大，上述的發現說明慢性關節炎的發生與生長因子在軟骨區的表達下調和軟骨細胞對生長因子反應低下有關。

Alexander等[20]從3位志愿者身上提取了鼻中隔軟骨細胞，研究者將軟骨細胞在人類血清中擴增，并將其分為兩組；一組培養在含2%人類血清的海藻酸鹽中，另一組培養在含10%人類血清的海藻酸鹽中，同時將胰島素樣生長因子1、BMP-2、BMP-7、BMP-13、GDF-5、TGF-β、胰島素和地塞米松的不同組合物加入上述培養液中，分別培養2周。2周后，通過測定糖胺聚糖的聚集量，選出聚集最多量糖胺聚糖的胰島素樣生長因子1和GDF-5組進行第二階段的試驗。在第二階段試驗中發現，胰島素樣生長因子1和GDF-5加入2%人類血清組與單純2%人類血清組相比，胰島素樣生長因子1和GDF-5組可以募集更多的糖胺聚糖和Ⅱ型膠原，生成的軟骨厚度是對照組的12倍。

6 GDF-5與脂肪來源間質干細胞分化

體外實驗證實，骨髓間充質干細胞在特定培養條件下可以分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌肉細胞[21-22]，并且將骨髓間充質干細胞移植至受損傷部位可以加強組織的修復[23-24]。近年來，脂肪間充質干細胞，即脂肪干細胞，因其與骨髓間充質干細胞相似的分化潛能、對特定誘導環境的高反應及來源廣泛易于分離提取成為了研究的熱點[25-26]。

Zeng等[27]在研究小鼠脂肪間充質干細胞分化為骨細胞的實驗中發現，加入了GDF-5的脂肪間充質干細胞培養液，在第4天就可以檢測到Cbfa1/Runx2(一種在骨形成早期表達的轉化因子)mRNA的高表達，而對照組僅在第14天微弱地表達了該基因，同時von Kossa染色證實GDF-5組礦化作用的證據最充分，同樣，GDF-5組上調了堿性磷酸酶(與骨細胞團活性相關)的活性及其基因的水平，以上三點充分說明了GDF-5在脂肪間充質干細胞分化早期即可完全地促進其分化為骨細胞。進一步的研究發現，GDF-5在細胞培養第14天可以顯著地上調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的基因表達，VEGF在骨分化過程中的具體作用尚不明確，然而有研究證實人重組VEGF-165能刺激骨的形成，提示GDF-5在骨再生方面的作用可能是多方面的[28-29]。

Feng等[30]在研究脂肪干細胞誘導分化為軟骨細胞的實驗時發現，GDF-5對于促進脂肪干細胞分化為軟骨細胞亦有重要作用，與對照組相比較，GDF-5組Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖基因(軟骨細胞特異性基因)的表達顯著增高，且不會促進Ⅰ型膠原蛋白和X型膠原蛋白(軟骨細胞肥大的標志)的表達，這種作用以100 μg/L的濃度為最佳。

Park等[31]發現，GDF-5可以促進脂肪間充質干細胞分化為肌腱組織細胞，并且這種作用是時間和濃度依賴性的。肌腱組織細胞外基質、Ⅰ型膠原、蛋白聚糖在100 μg/L GDF-5濃度時表達增加；而另一細胞外基質核心蛋白聚糖在1 μg/L和10 μg/L GDF-5濃度時表達增加。肌腱組織細胞特有的標志物堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子、腱調蛋白在100 μg/L GDF-5濃度時表達增加，而腱生蛋白C的表達在1000 μg/L GDF-5濃度下顯著增強。另外，研究還發現一些基質修復蛋白(主要參與肌腱損傷的修復)，如基質金屬蛋白酶3及基質金屬蛋白酶13的表達在10和1000 μg/L GDF-5濃度時增高，而其抑制蛋白基質金屬蛋白酶抑制蛋白2的表達在100 μg/L和1000 μg/L GDF-5濃度時降低，這些蛋白與肌腱受損傷修復相關，說明GDF-5在肌腱損傷修復過程中也起到一定作用。

7 GDF-5與神經元

GDF-5在腦部包括中腦在內的較多區域表達，在腹側中腦中的表達高峰出現在鼠胚胎第14天，此時多巴胺能神經元正經歷終末分化[32]。體外實驗證實，經過GDF-5治療的腹側中腦部細胞能增加多巴胺能神經元的存活率、改善其形態，并能保護其不受 1甲基4苯基吡啶離子介導的細胞凋亡[33-34]。Toulouse等[35]發現持續的GDF-5治療可以保護SH-SY5Y細胞免受6-羥多巴胺的神經毒性，這種保護作用可以在加入6-羥多巴胺之前、也可以在其加入之后發揮作用，這為帕金森綜合征的治療提供了一條新的線索。

8 GDF-5的其他作用

將30 μg GDF-5注射入韌帶損傷小鼠的膝關節，3周后，脛骨-韌帶-股骨復合物的強度增加了41%，硬度增加了60%，說明在韌帶損傷修復過程中GDF-5也有一定作用[36]。

有報道指出，在小鼠左心室心肌梗死模型中，GDF-5 mRNA的局部誘導表達在心肌梗死發生后的第7天顯著升高。GDF-5剔除的小鼠心肌梗死瘢痕擴大，左心室變大，左心室的彈性變差[37]。

9 結 語

GDF-5有廣泛地促進細胞分化的作用，能促使骨折的修復、軟骨的生成、修復韌帶組織，誘導脂肪細胞來源的間質干細胞分化成骨、軟骨和肌腱等組織，在神經系統和心血管系統也表現出一定的保護作用。GDF-5對于組織細胞以及機體干細胞的分化作用還有待于進一步深入研究。

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