Epiplakin及其研究進展

張 偉(綜述)，王文氫(審校)

(河北醫科大學第四醫院皮膚科，石家莊 050011)

1992年，Fujiwara等[1]描述了一個臨床和病理組織學改變類似大皰性類天皰瘡的表皮下水皰病患者。免疫印跡分析顯示患者血清沒有與BPAG1和BP180反應，而是識別了一個相對分子質量為45×104的表皮多肽，這個表皮多肽在人類角質形成細胞和一些像HeLa、KB、A431系的轉化細胞系中表達[2]。經研究，該抗原是plakin家族的成員,由于來源于表皮,故命名為Epiplakin(EPPK)，其獨特的分子結構使EPPK具有區別于其他家族成員的特征。

1 EPPK的組織定位

EPPK分布廣泛，EPPK在單層上皮及復層上皮都有定位。EPPK主要分布在肝臟、小腸、結腸、腮腺、腎、闌尾中，在胎盤、肺、腦、脊髓中分布較少[3]。最近研究發現，在頭發[4]、成年鼠視網膜神經節細胞、雙極細胞和馬勒神經膠質細胞、鼠胚胎視網膜、nestin陽性神經祖細胞[5]及胚胎早期及成年期胰腺、胰腺祖細胞和胚胎分化細胞[6]中也有EPPK表達。

2 EPPK的基因結構及分子結構

EPPK分子在人類和鼠類組織中均有表達，但種屬不同，其基因結構及分子結構也不完全相同，有各自的特點。

2.1人類EPPK的基因結構及分子結構 編碼人類EPPK的EPPK基因(EPPK1)是一個plakin家族基因，位于人類染色體8q24.3。根據2003年4月的UCSC人類基因瀏覽器(http://genome.ucsc.edu)，EPPK1長度為7524 bp。

EPPK1有獨特的結構：僅有1個15 195 kb的外顯子，包含13個亞單元，編碼13個核苷酸序列高度同源的plakin重復結構域(PRDs)，最后5個亞單位幾乎是完全相同的；研究發現在EPPK基因3′末端的5個同源重復結構域的連接區部分含有三核苷酸(GCC)n的重復序列，它們編碼聚丙氨酸。為了研究該分子的多態性，Takeo等[7]分離了15個健康人的DNA，運用套式聚合酶鏈反應擴增EPPK 3′末端的5個同源重復結構域的第一個，結果顯示正常人(GCC)n重復分布具有多態性，在5～9最多見的重復數為8，15條染色體中有5條是在第5個重復的GCC中有從G到A轉錄。說明這些個體微衛星區域存在多樣性。

人類EPPK的分子結構與同屬于plakin家族成員的橋粒蛋白不盡相同。幾乎所有的plakin家族成員分子結構都有一個共性：有一個球狀N端，C端的結構域被一個中央桿狀結構域隔開。橋粒蛋白是由球狀N端、中央螺旋桿樣結構域和C端的3個同源PRDs，A、B、C結構域和富含甘氨酸-絲氨酸-精氨酸結構區構成。PRDs是由38個氨基酸中4.5個副本構成，橋粒蛋白B和C亞結構分析顯示獨特折疊球狀結構[8]。

人類EPPK分子重要的特征是具有13個PRDs，13個PRDs與首次在橋粒蛋白C端發現的B結構域更相似，B結構域可以分為兩部分：一部分約70%是橋粒蛋白B結構域(3、6、8和13結構域)；另一部分45%～50%是橋粒蛋白B結構域(1、2、4、5和7結構域)。而且，9和13結構域及這5個結構域之后的連接區幾乎完全相同。在EPPK分子中沒有發現螺旋桿樣結構域和N端結構域，序列中沒有發現二聚體，表明EPPK在活體中可能以單鏈結構存在[3]。

2.2鼠類EPPK的基因結構及分子結構 鼠類EPPK1位于鼠第15號染色體的中間區域，分析顯示鼠的EPPK1包含一個不編碼的外顯子1、一個大的(-20 kb)編碼外顯子2及一個內含子。

鼠EPPK分子結構與人類EPPK不同，C端可識別的幾乎完全相同重復結構數目有8個。人和鼠EPPK分子B結構域的相似度比連接區的相似度更明顯，如人類和鼠類對應的第9個B結構域的氨基酸序列大約90%相同，而對應的連接區的氨基酸序列大約63%相同。與人EPPK分子B結構域相似，鼠的B結構域中，Ⅰ組與網蛋白第1個B結構域相比有約70%完全相同(3、6和8～16結構域)：Ⅱ組與網蛋白第1個B結構域相比有約50%或更少的相同程度(1、2、4、5和7結構域)[8-9]。

雖然人類和鼠類EPPK的B結構域高度同源，但兩種屬的連接區相對不同。連接區中的三核苷酸(GCC)n的重復序列僅位于人類EPPK1，因此微衛星長度異常導致的遺傳性皮膚病和核苷酸重復區域異常導致的中樞神經系統疾病僅限于人類[7]。

3 EPPK的功能

大多數plakin都是大分子，有特定的結構域，例如肌動蛋白結合結構域、螺旋狀螺旋桿結構域和PRDs。這些結構域通過與細胞骨骼相互作用錨定在膜結合復合體上維持組織的完整性[10]。同其他plakin家族成員一樣，EPPK是個大分子，然而，EPPK缺少中間部分的螺旋桿樣結構域及N端球狀結構域[3]。在活體中，EPPK獨特的重復結構域毫無疑問會影響到其分子功能[11]。

3.1人類EPPK與中間絲 Jang等[12]運用免疫染色、疊加分析和RNAi剔除法研究人類EPPK的作用時發現，重復單元(PRD+連接區)與角蛋白的結合力很強，也觀察到與波形蛋白的結合，只是作用較弱。EPPK基因剔除顯示單層上皮中間絲(intermediate filaments，IF)網狀結構的崩解。拯救實驗表明重復單元阻止了IF網狀結構的崩解，推測EPPK在單層上皮細胞中參與維持IF網狀結構的完整性。為進一步檢測EPPK與IF的結合能力，Wang等[13]利用包含有EPPK的一個結構單元及亞結構單元的融合蛋白行狹縫印跡(slot-blot)分析，結果顯示B結構域結合角蛋白至少需要4.6個拷貝中的2個。增加EPPK連接區內的重復結構的數目，EPPK與IF的結合力也會增強。在此研究中也檢測到EPPK與波形蛋白和肌間線蛋白有相似的結合，只是結合力較弱。實驗結果表明，EPPK的B和連接區結構域與中間絲間存在相互作用，EPPK的B和連接區結構域中的高度重復結構在分子的功能中起到了至關重要的作用。

3.2鼠類EPPK與中間絲

3.2.1正常情況下鼠類EPPK與中間絲 為了進一步研究EPPK的功能，Goto等[11]和Spazierer等[14]分別作出了EPPK基因剔除鼠(EPPK-/-鼠)。EPPK-/-鼠與野生鼠表現型無明顯差異：發育正常，表皮及毛發正常，有生育能力。Spazierer等[14]研究發現盡管EPPK在復層及單層上皮大量并高特異性表達，但鼠EPPK缺失未導致嚴重的皮膚功能障礙。Spazierer等[15]運用體外結合分析發現，幾乎所有鼠的EPPK的16PRDs與基底角質形成細胞的角蛋白結合。然而，在角質形成細胞初代培養中發現EPPK僅與部分IF網狀構造共存。通過角蛋白過度磷酸化、滲透性休克或紫外線照射方式給予細胞應力，整個胞質EPPK均與角蛋白結合。Time-course實驗顯示，絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸磷酸酶抑制物誘導的IF崩解速度在EPPK缺乏的分化角質形成細胞中的比野生鼠快。作者認為在應力存在的條件下EPPK對IF重建起到了重要作用，可能通過伴侶蛋白的方式抗崩解來保護IF[15]。

3.2.2創傷情況下鼠類EPPK與角蛋白 Goto等[11]發現EPPK-/-鼠背部創傷愈合速度較野生鼠和雜交鼠快。對EPPK剔除和EPPK過度表達的HeLa細胞的研究也發現EPPK剔除HeLa細胞的移動速度顯著增高，而EPPK過度表達的HeLa細胞的移動速度明顯被抑制[16]。野生鼠傷口邊緣，在增殖的角質形成細胞中表達的EPPK與K6連接。在EPPK-/-鼠中未發現類似的增殖角質形成細胞，但是遷移的角質形成細胞微弱地表達K6。在野生鼠外植體培養的一些角質形成細胞中EPPK與K6共表達，提示EPPK可能與K6存在功能上的聯系。

Ishikawa等[17]進一步研究野生鼠和EPPK-/-鼠在無創傷和有創傷情況下EPPK與角蛋白的關系，發現在無創傷的表皮中，與其他蛋白相比，EPPK更多地與角蛋白17(K17)共存。創傷后，EPPK-/-鼠和野生鼠中K5、K10、K6和K17的表達相同，但EPPK-/-鼠角質形成細胞中角蛋白絲更細。創傷野生鼠的免疫染色電鏡顯示EPPK與K5、K10和K6共存。提示在創傷愈合過程中，增殖的角質形成細胞EPPK加速角蛋白成束。

3.3EPPK的標記作用 EPPK1不僅在皮膚組織表達，在其他組織也檢測到了EPPK1。Yoshida等[5]在成年鼠視網膜中檢測到EPPK1 mRNA和蛋白，在胚胎視網膜nestin陽性細胞、成年鼠中視網膜神經節細胞、雙極細胞和馬勒神經膠質細胞中都有EPPK1表達，表明EPPK1與視網膜的發育有關。Yoshida等[6]在胚胎期胰腺上皮中發現了EPPK1+/Pdx1+和EPPK1+/Sox9+胰腺祖細胞。此后，EPPK1的表達局限在Ngx3+或Sox9+分泌祖細胞和p48+外分泌祖細胞中，在出生時EPPK表達局限在導管細胞和α細胞以及成年鼠胰腺中央腺管細胞和導管細胞中。先前被認為是胰腺導管腺癌前期損傷的胰腺上皮內瘤中檢測到了EPPK1。另外，因蛙皮素引起的急性胰腺炎(一種acinar細胞再生模型)，EPPK1陽性細胞也增多。EPPK1對檢測發育和重生胰腺的胰腺祖細胞來說是一種有用的標志物[6]。

Matsuo等[18]研究鼠發育和再生的肝臟時發現EPPK1在初期的雙向分化潛能的肝母細胞表達，以后限于在膽管細胞表達。出生后，EPPK1在膽管表達。在含乙硫氨酸無膽堿飼養的鼠肝臟中，EPPK1陽性細胞數量顯著增加并表達A6，表明此細胞為肝臟祖細胞。某些EPPK1陽性細胞表達一種增殖標志物增殖細胞核抗原，證明這些細胞是短暫的增殖細胞。所以，EPPK1可以作為探測發育中及成年肝臟中祖細胞的標志物。

3.4其他 Steiner等[4]研究鼠毛囊內毛根鞘交叉連接的蛋白，發現毛透明蛋白與EPPK交叉連接在毛囊的內毛根鞘細胞角化膜中，扮演了交叉橋架增強蛋白的角色。Fabre等[19]試圖識別腹瀉綜合征的致病基因，運用直接序列測定或結合分析，最終排除了EPPK1。Blagoev等[20]研究表皮生長因子受體通路時檢測到信號分子EPPK與表皮生長因子受體-Src同源膠原蛋白特異性結合形成復合物。

4 結 語

截止目前，EPPK在人類及鼠類中的基因和分子結構已全部探明，并證實了人類EPPK分子具有個體多態性，EPPK基因剔除鼠模型已制成，EPPK在創傷修復過程中，在機械外力下維持細胞完整性的作用正在進一步研究中。隨著對EPPK的深入研究，其與微衛星異常長度導致的遺傳性皮膚病和核苷酸重復區域異常導致的中樞神經系統疾病的關系，EPPK分子在廣泛分布的各種組織中的重大作用將會被逐漸發現。

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