氣升式反應器中高山被孢霉發酵生產花生四烯酸過程的動態溫度控制研究

高敏杰，王 成，鄭志永，朱 莉，詹曉北，*

（1.江南大學生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122；2.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122；3.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇無錫 214125）

氣升式反應器中高山被孢霉發酵生產花生四烯酸過程的動態溫度控制研究

高敏杰1，2，王 成1，2，鄭志永1，2，朱 莉3，詹曉北1，2，*

（1.江南大學生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122；2.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122；3.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇無錫 214125）

在利用高山被孢霉發酵生產花生四烯酸（Arachidonic Acid，ARA）過程中，考察了不同規模和培養環境下，單一以及動態溫度控制對菌體生長和ARA合成的影響。結果表明：相對于機械攪拌罐，利用氣升式反應器發酵生產ARA具有明顯優勢。同時，較高溫度（25℃）有利于高山被孢霉菌體生長，而較低溫度（16℃）有利于ARA合成。在此基礎上進行動態控溫發酵，即起始發酵溫度25℃，72h后以每12h下降1.5℃至16℃，然后保持16℃至發酵結束。采用此控制策略，ARA產量達到4.7g/L，與單一溫度（25℃）控制相比提高了38.2%。

高山被孢霉，花生四烯酸，機械攪拌罐，氣升式反應器，發酵溫度

花生四烯酸（Arachidonic Acid，ARA）是一種二十 碳 多 不 飽 和 脂 肪 酸（Polyunsaturated Fatty Acids，PUFAs），在人體中具有維持機體細胞膜結構與功能的重要作用[1]。ARA也是前列腺素、血栓素等重要活性物質的前體物質[2]。在醫藥、食品和農業等行業中，ARA還是一種應用廣泛的營養強化劑，被譽為“21世紀功能性食品主角”[3]。目前，ARA主要從動物組織（如肝臟、腎上腺和蛋黃等）中獲取，但動物組織中ARA含量很低，并且原材料來源有限，因此ARA的生產成本一直居高不下[4]。

微生物發酵法則為生產花生四烯酸開辟了新途徑，它具有不受原材料及氣候限制、生產周期較短、發酵工藝簡單、生產成本較低以及花生四烯酸含量高 等 特 點[5]。 因 此 ，采 用 微 生 物 發 酵 法 生 產 ARA 已是當前研究的熱點。目前，主要利用高山被孢霉（Mortierella alpina）進行ARA發酵生產，ARA產量與菌體生物量、總油脂含量和油脂中ARA的含量等密切相關，而它們主要都受外界環境如培養基的組成、反應器結構和發酵工藝等因素的影響[6-7]。ARA的發酵生產一般在機械攪拌罐中進行，產量已達到較高水平。但對一些剪切敏感型霉菌的培養，氣升式反應器具有剪切應力更溫和、罐體結構較簡單、能量耗散更均勻等優點，可以有效避免菌絲體易受損傷和菌體形態難以控制等問題[8]。在產油微生物菌體生長和油脂合成過程中，溫度起著重要的作用，M.alpina的最適生長溫度在15~25℃，而較低的溫度通常有利于長鏈脂肪酸的生產[9]。因此，對于ARA的發酵生產過程，最適的細胞生長溫度和產物生產溫度可能會有比較大的差異。

本研究首次進行了ARA在氣升式反應器中的發酵生產，同時考察了重要操作參數溫度變化對M.alpina的生長及ARA合成的影響。在此基礎上，提出一種動態溫度控制策略，以期獲得高生物量、油脂含量和ARA產量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高山被孢霉（Mortierella alpina）CFCC 88447 本實 驗 室 保 藏 ；葡 萄 糖 、豆 粕 、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、三氯甲烷、甲醇、氫氧化鈉、正己烷、三氟化硼、無水硫酸鈉等 均為國產分析純；酵母粉 Oxoid Ltd；CO2氣體、N2氣體、H2氣體 無錫新南化學氣體有限公司。

722分光光度計 上海精密科學儀器；DHG-9145A干燥箱 上海一恒科學儀器公司；PXY-DHS-35X40電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠；7820A氣相色譜儀 Agilent科技有限公司；1200L氣相色譜串聯質譜聯用儀 美國瓦里安公司；LC-20A液相色譜儀 日本島津公司；Bioflow 120機械攪拌發酵罐 美國New Brunswich Scientific公司；氣升式反應器 無錫市海信化機設備有限公司。

1.2 培養基

斜面培養基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然。

種子培養基（g/L）：葡萄糖30，豆粕粉10，酵母膏10，KH2PO43，NaNO33，MgSO4·7H2O 0.5，pH6.0。

發酵培養基（g/L）：初始葡萄糖50，豆粕粉10，KH2PO43，NaNO33，MgSO4·7H2O 0.5，pH6.0。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子培養 平板上挑取單菌落到種子培養基中，25℃，110r/min，培養48h。

1.3.2 搖瓶發酵 接種量10%（v），110r/min，溫度大小見結果與討論一節，初始pH6.0，發酵7d。

1.3.3 分批發酵（機械攪拌罐） 實驗采用7L機械攪拌罐（BioFlo 115，New Brunswick Scientific Co.，NJ，USA）進行分批發酵7d，接種量10%（v），裝液系數為0.6，攪拌轉速180r/min，溫度25℃，使用2.0mol/L NaOH控制發酵液pH為6.0。

1.3.4 恒速補料發酵（氣升式發酵罐） 實驗采用30L氣升發酵罐進行恒速補料分批發酵7d。接種量10%（v），裝液系數為0.6，通氣量1.0L/L/min，pH控制在6.0，發酵開始后恒速（6.12mL/h）流加補料液（700g/L葡萄糖）直至發酵結束。

1.3.5 分析方法 生物量測定：準確量取50mL發酵液進行真空過濾（直徑7cm中速定量濾紙），用蒸餾水沖洗至流出液無色，將菌體置于平皿中，105℃下烘干至恒重，稱菌體干重。生物量計算公式：生物量（g/L）=菌體干重（g）/發酵液體積（L）。

1.3.5.1 菌球直徑的測定 發酵結束后，取2mL搖勻后的發酵液倒入培養皿中，加入20mL去離子水稀釋后從中隨機選取30個菌球，以游標卡尺為參照逐個測定菌球直徑，計算平均值和標準差。

1.3.5.2 葡萄糖含量測定 DNS法測定發酵液中殘留的葡萄糖含量[10]。

1.3.5.3 總油脂含量測定 精確稱取干燥后的菌體0.5g，置于研缽中充分研磨至粉狀，轉移到7mL離心管中，加入3mL CHCl3-MeOH溶液（v/v=1∶2），劇烈振蕩抽提1min，再加入1mL CHCl3溶液，再次劇烈振蕩1min，最后加入1mL去離子水，振蕩萃取1min，靜置30min后溶液分層，將下層有機相全部取出至預先稱重的5mL離心管中，水浴（80℃，4h）將有機相蒸干，干燥后再次稱重離心管重量，減去空離心管的重量即為總油脂的重量[11]。

脂肪酸含量測定：精確稱取總油脂0.1g，加入2mL 0.5mol/L的NaOH-MeOH溶液，60℃水浴加熱至油 脂 完 全 溶 解 ，冷 卻 后 加 入 2mL 25%（v/v）的 BF3-MeOH溶液，60℃水浴酯化20min，再次冷卻后加入2mL正己烷并振蕩混勻，最后加入2mL NaCl飽和溶液并振蕩，靜置30min后取上層有機相于一只干燥試管中，并加入少量無水硫酸鈉以去除微量水分，供GC/MS分析使用[12]。

GC/MS分析采用美國瓦里安公司氣相色譜串聯質譜聯用儀1200L GC/MS；色譜條件：色譜柱為DB-225，30m×0.25mm×0.15μm毛細管柱；載氣，He氣；流量，1mL/min，不分流進樣；程序升溫條件為：初始溫度180℃，維持2min，以5℃/min速率升溫至230℃，維持12min；質譜條件：接口溫度，250℃；離子源溫度，200℃；離子化方式，EI；電子能量，70eV；檢測電壓，350V；發射電流，200μA。

表1 高山被孢霉菌體中油脂組分分析Table 1 Components of lipids produced by M.alpina

2 結果與討論

2.1 搖瓶條件下溫度對高山被孢霉菌體生長、總油脂和ARA合成的影響

溫度對產油微生物菌體生長和油脂合成影響很大，特別是低溫條件對促進PUFAs合成具有重要意義。高山被孢霉菌體的生長和目標產物ARA的生物合成過程均是在一系列酶的催化作用下進行的，只有在最適溫度下酶的活性才會最高。對高山被孢霉來說，最適溫度是指既有利于菌體生長又有利于目標產物ARA合成的溫度，但有文獻報道高山被孢霉最適生長溫度和PUFAs合成的最適溫度往往不一致，最適生長溫度往往高于PUFAs合成的最適溫度[13]。

為了考察溫度對本株高山被孢霉菌體生長和ARA合成影響，在搖瓶水平對發酵溫度進行了研究。分別將三角瓶置于13、16、19、22、25、28℃六種不同溫度下培養7d，每個溫度條件做了3個平行實驗。由圖1可以看出，較高溫度（25~28℃）有利于菌體生長，其中菌體生物量在25℃時達到最高，為35.8g/L。當溫度由25℃逐漸降低至13℃時，菌體生長明顯受到抑制，菌體生物量只有19.2g/L。但是從表2可以看出，在較低溫度（13~19℃）下，PUFAs在總油脂中所占比例明顯較高，說明低溫對PUFAs積累具有促進作用，16℃時比例達到最高，為37.2%，而25℃時油脂中ARA比例比16℃時低了19.2%，可見較低發酵溫度對目標產物ARA的積累是有利的。

分析原因，可能是低溫條件會促使菌體合成更多的PUFAs，因為PUFAs可以更好的保持低溫環境下菌體細胞膜的流動性，維持細胞正常的生理功能[14]，是 菌 體 適 應 不 利 外 界 環 境 的 一 種 自 我 保 護 手 段[15]。另外溶氧在ARA合成途徑中具有重要作用，而較低的發酵溫度也有利于增加發酵液中氧的溶解度，使細胞內形成大量分子氧，一定程度上提高了脂肪酸脫飽和酶活性，對ARA的合成同樣具有促進作用[16-17]。

圖1 搖瓶發酵溫度對ARA合成影響Fig.1 Effect of temperature on ARA biosynthesis in shaking-flask cultivation

表2 不同溫度搖瓶發酵時脂肪酸組分分析Table 2 Fatty acid composition analysis under various temperatures by M.alpina

圖2 機械攪拌發酵罐發酵菌體生長、總油脂和ARA合成曲線Fig.2 Time course of cell growth lipid and ARA accumulation in mechanical string fermentation

圖3 搖瓶發酵和機械攪拌罐發酵時菌體形態Fig.3 Effect of two fermentation methods on morphology of M.Alpine

2.2 機械攪拌罐發酵生產ARA情況

為擴大高山被孢霉發酵生產ARA規模，在7L機械攪拌發酵罐水平進行放大研究。從圖2菌體生長和產物合成曲線可以看出，在0~96h發酵階段菌體生長良好，但發酵至96h后菌體生物量、總油脂和ARA產量都出現迅速下降，發酵過程ARA最高產量只有0.6g/L。比較搖瓶發酵和機械攪拌罐發酵時菌體形態可以發現，兩種發酵條件下菌體形態差異很大，搖瓶發酵時菌體主要呈球狀（圖3a），而機械攪拌罐內的菌體呈羽狀（圖3b），同時在顯微鏡下也可以發現搖瓶內的菌絲平均長度大于機械攪拌罐內的菌絲平均長度。這說明在機械攪拌罐內，槳葉攪拌產生的剪切力造成高山被孢霉菌絲斷裂，菌絲不易互相纏繞形成最適菌球形態，不利于油脂和ARA合成。另一方面，斷裂的羽狀菌絲體會分散在發酵液中，使發酵液變得更為黏稠，發酵過程中氧傳質阻力增加，不利于菌體的氧攝取[18]。隨著發酵進行大量羽狀的菌絲易在發酵罐擋板和攪拌槳上聚集和結塊，形成大型的菌團，過厚的菌團同樣會阻止氧氣的傳遞，導致菌團內部的菌絲因缺氧而過早衰老和死亡。雖然相關文獻報道中都利用機械攪拌罐成功發酵生產ARA，但機械攪拌罐并不適用于本菌株[19]。分析原因，一方面可能因不同高山被孢霉菌株產ARA的能力不同，另一重要原因可能是本菌株對剪切力更加敏感，機械攪拌時難以維持良好的菌球形態，最終導致發酵的失敗，因此接下來嘗試使用剪切力溫和的氣升式反應器發酵生產ARA。

2.3 氣升式反應器中不同溫度對細胞生長和ARA合成的影響

在30L氣升式反應器上分別對25℃和16℃發酵時高山被孢霉菌體生長和ARA合成情況進行研究。觀察整個發酵過程，高山被孢霉菌體保持良好形態，大部分菌體保持球狀形態且沒有出現明顯菌塊，解決了機械攪拌罐發酵時菌絲斷裂和發酵液粘度不斷增加的問題。從表3可以看出，25℃條件下總油脂積累與生物量有很大關聯，發酵結束時生物量和ARA產量分別為34.6g/L和3.4g/L。雖然16℃條件下菌體生長較慢，最終生物量僅為23.5g/L，但低溫條件下ARA占總油脂的比例提高到了31%，ARA的產量達到3.2g/L。同時對25℃和16℃發酵條件下菌體比生長速率和ARA比合成速率分析發現，25℃時菌體最大比生長速率和最大比合成速率，分別明顯高于16℃的最大比生長速率和最大比合成速率（圖4）。發酵0~ 72h之間，25℃對應的菌體比生長速率明顯高于16℃，說明較高溫度確實有利于菌體的生長；發酵至72h后，16℃對應的ARA比合成速率已經明顯高于25℃的比合成速率，并且維持較長時間，說明適當降低發酵溫度對發酵后期ARA的積累具有明顯促進作用。

表3 25℃和16℃氣升式反應器發酵時菌體生長和ARA合成情況Table 3 Cell growth and ARA biosynthesis in airlift reactor cultures with 25℃ and 16℃

圖4 氣升式反應器發酵時溫度對菌體比生長速率和ARA比合成速率的影響Fig.4 Effect of temperature on cell specific growth rate and ARA specific formation rate in airlift reactor

圖5 動態控溫發酵曲線Fig.5 The dynamic temperature-control fermentation curve

表4 動態控溫發酵對ARA合成影響數據匯總Table 4 Summary of dynamic temperature-control on ARA biosynthesis by M.alpina

2.4 氣升式反應器中動態控溫策略提高ARA產量

通過以上對溫度的研究發現，適合高山被孢霉菌體生長的最適溫度與ARA合成最適溫度并不一致，較高溫度（25℃）更有利于菌體的生長，而較低溫度（16℃）時，ARA在總油脂中的比例更高。目標產物ARA的最終產量主要由菌體生物量和菌體總油脂中ARA比例決定。發酵溫度分階段控制是一種經典的過程優化方式，可以在獲得較高菌體生物量同時盡可能提高總油脂中ARA比例，最終提高ARA產量[20]。而采用線性下降的溫度變化方式主要考慮細胞對溫度變化的適應過程，避免突然的階梯式溫度變化對細胞生長和產物合成的不利影響。進行動態控溫發酵實驗的發酵條件為：0~72h階段菌體生長代謝旺盛，對環境溫度的變化比較敏感，保持此階段溫度為25℃有利于菌體生長，可以獲得更高生物量，同時一定程度上縮短發酵周期。72h后菌體生長速率逐漸放緩，進入穩定期，選擇72h做為變溫的起點，以每12h下降1.5℃速率逐漸將溫度降至16℃，然后維持16℃至發酵結束，結果如圖5所示。發酵開始后菌體干重迅速增加，發酵至72h菌體生物量已經達到一定水平（26.5g/L），72h后隨著溫度逐漸降低，ARA的合成速率不斷提高。最終生物量和ARA產量分別達到32.2g/L和4.7g/L。與非變溫（25℃）發酵相比，生物量和總油脂基本達到相同的水平，但油脂中ARA百分比有了明顯增加，由22.1%提高至30.3%（表4）。因此利用動態控溫發酵提高ARA產量是可行的，整體發酵性能提升明顯。

3 結論

主要考察了不同規模和培養環境下，重要操作參數溫度對M.alpina菌體生長及ARA合成的影響。研究發現對于本實驗菌株，采用氣升式反應器發酵生產ARA具有更大優勢，可以解決機械攪拌罐發酵時菌絲斷裂、發酵中后期菌體結塊和ARA產量過低等問題。同時，M.alpina菌體生長與目的產物ARA合成的發酵最適溫度并不相同，較高溫度（25℃）有利于菌體生長，較低溫度對PUFAs積累具有促進作用，16℃時油脂中ARA比例最高。由此提出一種動態控溫發酵策略，采用此策略，ARA最高濃度達到4.7g/L，與單一溫度（25℃）控制相比產量提高了38.2%。當然，在利用氣升式反應器發酵生產ARA過程中還有其他重要參數與ARA產量的提高密切相關，需要更深入的研究和分析。

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Study on improved arachidonic acid production by Mortierella alpina with dynamic temperature-control in airlift bioreactor

GAO Min-jie1，2，WANG Cheng1，2，ZHENG Zhi-yong1，2，ZHU Li3，ZHAN Xiao-bei1，2，*
（1.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology of Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Jiangsu Rayguang Biotechnology Co.，Ltd.，Wuxi 214125，China）

Constant and dynamic temperature-control was inverstigated for efficient arachidonic acid （ARA）production by Mortierella alpine in different fermentation scales and environments.The results showed that airlift bioreactor was more suitable for ARA production process compared with mechanical stirring fermentor. Meanwhile，cell growth rate showed to be optimum at 25℃ ，while ARA ratio in lipid showed to be maximal at 16℃ .As a result，a dynamic temperature-control strategy，in which the culture temperature was controlled at 25℃ at the first 72h and linearly decreased 1.5℃ for every 12h till 16℃ ，then kept at 16℃ for the rest of the fermentation，was developed in the airlift bioreactor.With this control strategy，the ARA production level reached 4.7g/L which was increased 38.2%compared with the level of constant temperature（25℃） control strategy.

Mortierella alpina ； arachidonic acid ； mechanical stirring fermentor ； airlift reactor ； fermentation temperature

Q815

A

1002-0306（2014）22-0179-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.031

2014－07－16

高敏杰（1980-），男，副教授，研究方向：生化過程優化與控制。

* 通訊作者：詹曉北（1962-），男，教授，研究方向：生化工程與反應器。

“十二五”國家科技支撐計劃子課題（2011BAD23B04）；國家高技術研究發展計劃子課題（2012AA021505）。