酰基化藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性研究

趙立儀，李路寧，申芮萌，朱 寧，孫愛東，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京 100083；2.北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

酰基化藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性研究

趙立儀1，2，李路寧1，2，申芮萌1，2，朱 寧1，2，孫愛東1，2，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京 100083；2.北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

采用月桂酰氯作為酰化試劑與自提藍(lán)莓花青素酰化，對(duì)酰化后產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，并對(duì)不同濃度添加劑、金屬離子以及氧化還原劑對(duì)酰化后藍(lán)莓花青素穩(wěn)定性的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：酰化后藍(lán)莓花青素對(duì)光、熱和強(qiáng)氧化劑穩(wěn)定性顯著提高；VC、苯甲酸鈉、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸鈉等可以提高酰化后藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性。K+、Na+、Cu2+以及濃度小于0.05mol/L的Fe2+對(duì)其無顯著性影響；Ca2+/Fe3+以及濃度達(dá)到0.1mol/L的Mg2+、Fe2+對(duì)其具有破壞作用。

藍(lán)莓花青素，酰基化，穩(wěn)定性

藍(lán)莓（Blueberry）又稱越桔，杜鵑花科越桔屬多年生落葉或常綠灌木，分布于亞寒帶、溫帶及亞熱帶。藍(lán)莓果實(shí)為漿果，果肉細(xì)膩，酸甜適度，既可以鮮食，也可以加工成果汁飲料、果酒飲品等。藍(lán)莓除含常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)成分外，還含有豐富的花青素。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，花青素具有保護(hù)和改善視力，治療心血管疾病，預(yù)防肥胖，防止腦神經(jīng)老化，預(yù)防癌癥等功能[1-2]。藍(lán)莓花青素是水溶性色素，在光照、高溫和氧氣的作用下很容易被降解，成為阻礙其在食品工業(yè)中應(yīng)用的瓶頸。為了改善花青素的穩(wěn)定性，擴(kuò)大此類色素的應(yīng)用領(lǐng)域，人們分別采用加輔色劑、抗氧化劑、螯合劑、微膠囊以及化學(xué)修飾的方法來提高花青素的穩(wěn)定性[3-5]。國(guó)內(nèi)外大多采用乙酸等羧酸作為酰化劑，酰化效果不理想，反應(yīng)進(jìn)行較慢。本文采用月桂酰氯作為酰化劑，將藍(lán)莓花青素酰化，較之前研究反應(yīng)更為徹底迅速。并研究酰基化藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性，這對(duì)進(jìn)一步開發(fā)利用藍(lán)莓花青素具有重要意義[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生藍(lán)莓樣品 產(chǎn)于大興安嶺林區(qū)，-80℃冷凍保存；色譜純甲醇 購(gòu)于Fisher公司；月桂酰氯、甲醇、三氟乙酸、TFA、蒸餾水、蔗糖、葡萄糖、雙氧水、硫酸亞鐵、硫酸鈉、氯化鉀、檸檬酸、檸檬酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上化學(xué)試劑 除特殊說明外均為分析純。

水浴鍋 天津?qū)嶒?yàn)電爐有限公司；UV-1200紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Senco旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司；FA1604N電子分析天平 上海精密儀器廠；JB-5型定時(shí)雙向數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FD-18真空冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓花青素的提取 參考Fossen等[8]方法并加以改進(jìn)。將在-80℃下貯藏的藍(lán)莓鮮果在0℃下解凍24h，然后將其研磨成漿，按照料液比1∶5加入含0.5%三氟乙酸（TFA）的甲醇溶液，在0℃下封口、遮光攪拌提取24h。將提取液置于5000r/min的離心機(jī)中離心15min，收集上清液。取上清液于低于38℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，除去甲醇，得到濃縮液。

1.2.2 藍(lán)莓花青素的純化 將濃縮液用1∶1（V∶V）乙酸乙酯萃洗，反復(fù)振蕩，除去上層脂類物質(zhì)，將此操作反復(fù)3次。將除去脂類的濃縮液通入離子交換樹脂XAD-7柱，用含0.5%TFA的蒸餾水以20倍柱體積沖洗柱子，除去非花青素化合物。然后通入含0.5%TFA的甲醇洗脫柱子，收集洗脫液。將收集的洗脫液于38℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空濃縮除去甲醇，得到純化的花青素溶液。

1.2.3 藍(lán)莓花青素的酰化 參考李穎暢[9]的方法并加以改進(jìn)，將提純的藍(lán)莓花青素溶液與月桂酰氯以1∶3的比例混合，在90℃下水浴加熱40min，取出后冷卻至室溫，用紫外可見分光光度計(jì)在200~400nm處測(cè)定光譜，觀察在290~330nm是否有吸收峰，如果有則說明發(fā)生了酰基化[10]。將冷卻后的藍(lán)莓花青素酰化溶液用pH=3的檸檬酸-檸檬酸鈉溶液稀釋50倍，用于穩(wěn)定性的測(cè)量。

1.2.4 不同條件對(duì)酰化藍(lán)莓花青素穩(wěn)定性的影響

1.2.4.1 已酰化花青素保存率的測(cè)定方法[11-13]分別取稀釋后樣品1mL，加入pH為1.0、4.5的緩沖液9mL，40℃水浴平衡40min后，于304nm和548nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并按下式進(jìn)行計(jì)算：

花青素含量（mg/L）=（A×MW）/（∑×1）×Df×1000保存率（%）=A2/A1×100

式中，MW為酰化后的矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量；∑-摩爾消光系數(shù)；Df-稀釋因子（樣品總的稀釋倍數(shù)）；A2已處理的酰化花青素吸光值；A1未處理的酰化花青素吸光值。

pH1.0的緩沖液：準(zhǔn)確稱取1.49g KCl用蒸餾水定容至1009mL。準(zhǔn)確量取1.7mL鹽酸（分析純）用蒸餾水定容至100mL，配成0.2mol/L鹽酸溶液，將KCl溶液與鹽酸溶液以25∶67的比例混合。用KCl溶液調(diào)pH（1.0±0.1）。

pH4.5的緩沖液：準(zhǔn)確稱取1.64g醋酸鈉用蒸餾水定容至100mL，用鹽酸調(diào)pH（4.5±0.1）。

1.2.4.2 酰化藍(lán)莓花青素的熱穩(wěn)定性 將已稀釋的酰化藍(lán)莓花青素溶液分別取30mL 3份放入80、100、120℃的水浴鍋中，每隔一定時(shí)間（2、4、6、8、10h）測(cè)定其含量變化。

1.2.4.3 酰化藍(lán)莓花青素的光穩(wěn)定性 取已稀釋的酰化藍(lán)莓花青素50mL裝入白色試劑瓶中，在自然光照條件下貯存。每隔2d測(cè)定其含量變化。

1.2.4.4 添加劑對(duì)酰化藍(lán)莓花青素的影響 取已稀釋的酰化藍(lán)莓花青素每份30mL分別加入不同濃度的VC、蔗糖、葡萄糖、苯甲酸鈉、檸檬酸，對(duì)照組加30mL蒸餾水，室溫靜置2h，測(cè)定其含量變化。

1.2.4.5 金屬離子對(duì)酰化藍(lán)莓花青素的影響 取已稀釋的酰化藍(lán)莓花青素每份30mL，分別加入不同濃度的Na+、K+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+在2、4、6、8、10h測(cè)定其含量變化。

1.2.4.6 氧化還原劑對(duì)酰化藍(lán)莓花青素的影響 取已稀釋的酰化藍(lán)莓花青素每份30mL，分別加入不同濃度的亞硫酸鈉、過氧化氫溶液，靜置30min，測(cè)定其含量變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 酰化藍(lán)莓花青素的紫外吸收光譜

測(cè)定酰化藍(lán)莓花青素在200~400nm的吸收光譜，觀察在290~330nm是否有明顯吸收峰，如果有則說明發(fā)生了酰基化[10]。藍(lán)莓花青素與月桂酰氯發(fā)生酰化反應(yīng)后，在紫外光譜中304nm處出現(xiàn)吸收峰，如圖1所示，說明藍(lán)莓花青素已經(jīng)酰化。

圖1 酰基化藍(lán)莓花青素紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 The ultraviolet-visible absorption spectrum of acylated blueberry anthocyanins

圖2 加熱80℃對(duì)酰化花青素和未酰化花青素的影響比較Fig.2 Effect comparison of 80℃ between the acylated anthocyanins and proanidine

2.2 溫度對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素的影響

由圖2~圖4可以看出，隨著溫度的升高和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，酰化的藍(lán)莓花青素和未酰化的藍(lán)莓花青素的保留率都下降。但從圖中可以看出，在80、100、120℃加熱0~2h，酰化花青素和未酰化花青素的保留率沒有顯著性差距，但當(dāng)加熱時(shí)間大于4h后未被酰化的藍(lán)莓花青素下降速率明顯高于酰化的藍(lán)莓花青素，說明藍(lán)莓花青素酰化后耐熱性提高。在80、100、120℃加熱10h后酰化的藍(lán)莓花青素保留率分別為83.24%、74.17%和62.17%，明顯高于未被酰化的藍(lán)莓花青素，說明藍(lán)莓花青素酰化后熱的穩(wěn)定性顯著（p＜0.05）提高。

2.3 光照對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素的影響

圖3 加熱100℃對(duì)酰化花青素和未酰化花青素的影響比較Fig.3 Effect comparison of 100℃ between the acylated anthocyanins and proanidine

圖4 加熱120℃對(duì)酰化花青素和未酰化花青素的影響比較Fig.4 Effect comparison of 120℃ between the acylated anthocyanins and proanidine

圖5 光照對(duì)已酰化和未酰化藍(lán)莓花青素的影響比較Fig.5 Effect comparison of light between the acylated anthoocyanins and proanidine

由圖5可知，酰化的和未酰化的藍(lán)莓花青素隨光照時(shí)間的延長(zhǎng)穩(wěn)定性下降，但酰化后的藍(lán)莓花青素的光穩(wěn)定性顯著高于未酰化的藍(lán)莓花青素，光照6d時(shí)，已酰化藍(lán)莓花青素的保留率在90%以上，而未酰化花青素的保留率已降到80%以下；光照10d后酰化花青素的保留率依然維持在80%以上，而未酰化花青素保留率為64.37%。由此可知，藍(lán)莓花青素酰化后的光穩(wěn)定性顯著（p＜0.05）高于未酰化花青素，對(duì)光的耐受力也增強(qiáng)。

2.4 添加劑對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響

2.4.1 VC對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響 由圖6可知，隨著VC添加量的增加，已酰化花青素的保留率變化趨勢(shì)較未添加VC的已酰化花青素呈總體升高趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，不同添加量的VC對(duì)已酰化花青素的保留率有增強(qiáng)作用，10h后已酰化花青素的保留率均在90%左右。由方差分析可知，添加不同濃度的VC對(duì)已酰化花青素的穩(wěn)定性影響沒有顯著性的差異（p＞0.05），但已添加VC較未添加VC的已酰化花青素穩(wěn)定性顯著（p＜0.05）提高，說明適量添加VC可以增加已酰化花青素的穩(wěn)定性。

圖6 VC對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素的影響Fig.6 Effect of VCon the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.4.2 蔗糖對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響由圖7可知，與對(duì)照組相比，隨著蔗糖添加量的增大，已酰化花青素的保留率總體呈逐漸增加趨勢(shì)。當(dāng)蔗糖的添加量達(dá)到30%時(shí)，已酰化花青素放置10h后保留率仍為85%以上。由方差分析可知，添加不同濃度的蔗糖對(duì)已酰化花青素的穩(wěn)定性影響沒有顯著性差異（p＞0.05）。但當(dāng)蔗糖的添加量達(dá)到30%時(shí)，已酰化花青素的穩(wěn)定性顯著（p＜0.05）高于未添加蔗糖的酰化花青素，說明添加適量的蔗糖可以增加已酰化花青素的穩(wěn)定性。

圖7 蔗糖對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of sucrose on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.4.3 葡萄糖對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響

由圖8可以看出，與對(duì)照組相比，隨著葡萄糖添加量的增大，已酰化藍(lán)莓花青素的保留率也逐漸增大，當(dāng)葡萄糖添加量達(dá)到30%時(shí)，已酰化花青素放置10h保留率基本在80%以上。由方差分析可知，添加不同濃度的葡萄糖對(duì)已酰化花青素的穩(wěn)定性影響沒有顯著性差異（p＞0.05）。但當(dāng)葡萄糖添加量大于10%時(shí)，較未添加葡萄糖的酰化花青素穩(wěn)定性顯著（p＜0.05）提高，說明添加適量的葡萄糖同蔗糖一樣都可以增加已酰化花青素的穩(wěn)定性。

圖8 葡萄糖對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of glucose on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.4.4 苯甲酸鈉對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響 由圖9可知，隨著苯甲酸鈉添加量的增加，已酰化花青素的保留率也逐漸增加，苯甲酸鈉的添加量達(dá)到1%時(shí)，已酰化花青素的保留率在90%左右。由方差分析知，添加不同濃度的苯甲酸鈉對(duì)已酰化花青素的穩(wěn)定性影響沒有顯著性差異（p＞0.05）。但當(dāng)苯甲酸鈉添加量大于0.25%時(shí)，較未添加苯甲酸鈉的酰化花青素穩(wěn)定性顯著（p＜0.05）提高，說明添加適量的苯甲酸鈉對(duì)花青素的穩(wěn)定性有一定程度的增強(qiáng)作用。

圖9 苯甲酸鈉對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of sodium benzoate on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.4.5 檸檬酸對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響 由圖10可知，在添加不同濃度的檸檬酸0~2h，與對(duì)照組相比，已酰化的花青素保留率有所下降，但仍然維持在90%以上，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和檸檬酸添加量的增加，已酰化的花青素保留率較對(duì)照組有所增加。當(dāng)添加量達(dá)到30%時(shí)仍然維持在85%以上。由方差分析可知，添加不同濃度的檸檬酸對(duì)已酰化花青素穩(wěn)定性影響沒有顯著性差異（p＞0.05）。但已添加檸檬酸的已酰化花青素較未添加的穩(wěn)定性顯著（p＜0.05）提高，說明添加適量的檸檬酸對(duì)已酰化花青素的穩(wěn)定性有一定程度的增強(qiáng)作用。

圖10 檸檬酸對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of citric acid on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.5 金屬離子對(duì)藍(lán)莓中花青素穩(wěn)定性的影響

圖11 Na+、K+、Cu2+對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of Na+、K+、Cu2+on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

由圖11可知，與對(duì)照組相比，不同濃度的Na+、K+、Cu2+對(duì)已酰化藍(lán)莓花青素的保留率影響趨勢(shì)大致相同，10h后已酰化花青素的保留率在75%以上。由方差分析可知，添加不同濃度的Na+、K+、Cu2+已酰化花青素的穩(wěn)定性影響沒有顯著性差異（p＞0.05）。說明不同濃度的Na+、K+、Cu2+對(duì)花青素的穩(wěn)定性無顯著影響。

圖12 Ca2+對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響Fig.12 Effect of Ca2+on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

由圖12可知，隨著Ca2+濃度的增加，藍(lán)莓中已酰化花青素的保留率降低趨勢(shì)較明顯，當(dāng)Ca2+濃度達(dá)到0.1mol/L時(shí)，10h后已酰化藍(lán)莓花青素的保留率降低到75.01%，與對(duì)照組向比，花青素的保留率降低。由方差分析可知，添加不同濃度的Ca2+對(duì)已酰化藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性影響沒有顯著性性差異（p＞0.05）。但添加不同濃度的Ca2+對(duì)已酰化藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性較未添加的有顯著（p＜0.05）降低，因此添加Ca2+對(duì)已酰化藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性具有破壞作用

由圖13可知，濃度為0.01mol/L的Mg2+使已酰化花青素的保留率略高于對(duì)照組，而當(dāng)濃度達(dá)到0.1mol/L的Mg2+則使已酰化花青素的保留率降低。由方差分析可知，添加不同濃度的Mg2+對(duì)已酰化花青素的穩(wěn)定性影響有顯著性差異（p＜0.05）。說明低濃度的Mg2+對(duì)已酰化花青素具有一定程度的保護(hù)作用，而大于0.1mol/L的Mg2+對(duì)已酰化花青素具有一定程度的破壞作用。與對(duì)照組相比，加入Fe3+的已酰化花青素保留率均呈現(xiàn)大幅度下降趨勢(shì)，且Fe3+濃度越大，已酰化花青素的保留率越低，當(dāng)Fe3+濃度達(dá)到0.1mol/L時(shí)，10h后已酰化花青素的保留率降到48.08%。由方差分析可知，添加不同濃度的Fe3+對(duì)已酰化花青素的穩(wěn)定性影響有顯著性差異（p＜0.05）。說明Fe3+對(duì)花青素的穩(wěn)定性的破壞作用隨濃度的增大而增加。與對(duì)照組相比，F(xiàn)e2+的濃度小于0.05mol/L時(shí)，對(duì)已酰化花青素的保留率無顯著影響，10h后均維持在80%左右；而當(dāng)濃度達(dá)到0.1mol/L時(shí)，F(xiàn)e2+會(huì)使已酰化花青素的保留率降低，10h后保留率為74.11%。由方差分析知，添加不同濃度的Fe2+對(duì)已酰化花青素的穩(wěn)定性有顯著性差異（p＜0.05）。說明濃度小于0.05mol/L的Fe2+對(duì)已酰化花青素穩(wěn)定性影響較小，濃度達(dá)到0.1mol/L的Fe2+對(duì)已酰化花青素的穩(wěn)定性具有一定的破壞作用。

圖13 Mg2+、Fe3+、Fe2+對(duì)藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響Fig.13 Effect of Mg2+，F(xiàn)e3+，F(xiàn)e2+on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

圖14 過氧化氫對(duì)已酰化和未酰化藍(lán)莓花青素穩(wěn)定性影響比較Fig.14 Effect of H2O2on the stability comparison between acylated anthoanins and proanidine

2.6 氧化還原劑對(duì)藍(lán)莓中已酰化和未酰化花青素穩(wěn)定性的影響比較

2.6.1 過氧化氫對(duì)藍(lán)莓中已酰化和未酰化花青素穩(wěn)定性的影響比較 由圖14可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，過氧化氫對(duì)已酰化花青素的影響顯著（p＜0.05），保留率下降明顯，反應(yīng)物顏色變淺，是因?yàn)檫^氧化氫為強(qiáng)氧化劑，與已酰化花青素反應(yīng)明顯。但添加相同濃度的過氧化氫，未酰化的花青素比已酰化的藍(lán)莓花青素保留率下降趨勢(shì)快，因此，已酰化的藍(lán)莓花青素對(duì)強(qiáng)氧化劑的穩(wěn)定性提高。

2.6.2 亞硫酸鈉對(duì)藍(lán)莓中已酰化和未酰化花青素穩(wěn)定性的影響比較 由圖15可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，亞硫酸鈉對(duì)已酰化花青素的影響顯著（p＜0.05），保留率下降明顯，反應(yīng)物顏色變淺，是因?yàn)閬喠蛩徕c為強(qiáng)還原劑，與已酰化花青素反應(yīng)明顯。但添加相同濃度的亞硫酸鈉，未酰化的花青素比已酰化的藍(lán)莓花青素保留率下降趨勢(shì)快，因此，已酰化的藍(lán)莓花青素對(duì)強(qiáng)還原劑的穩(wěn)定性提高。

Study on stability of acylated blueberries anthocyanins

ZHAO Li-yi1，2，LI Lu-ning1，2，SHEN Rui-meng1，2，ZHU Ning1，2，SUN Ai-dong1，2，*
（1.Department of Food Science，College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；2.Beijing Forestry University，key laboratory of Forestry Food Processing and Security，Beijing 100083，China）

The molecular modification of blueberry in this experiment was acylated by using dodecanoyl chloride. Meanwhile，these experiments studied the stabilities（temperature，illumination，additive，metal ion，strong oxidizer reducer） of anthocyanin acylation of blueberry，The studies indicated that acylated anthocyanins were improved obviously in the stabilities of temperature，illumination and strong oxidizer reducer comparing with the blueberry anthocyanin of no acylation.The experiments showed that adding different concentration gradients additive （VC，Sodium Benzoate，sucrose，glucose，sodium citrate） could improve the stabilities of acylated anthoanins.K+，Na+，Cu2+and Fe2+（concentration was lower than 0.05mol/L had no obvious affection to the acylated anthoanins’stabilities.Ca2+，F(xiàn)e3+and Mg2+，F(xiàn)e2+（concentration was lower than 0.1mol/L） had the destructive effects to the stabilities of acylated anthoanins.

blueberry anthocyanin；acylation；stability

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0299-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.057

2014－02－28

趙立儀（1991-），女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物生理活性的開發(fā)與利用。

* 通訊作者：孫愛東（1968-），女，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物生理活性的開發(fā)與利用。

國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目（31271981）；科技部十二五課題（2012BAD31B05）。