長鏈非編碼RNA HOTAIR在腫瘤中的研究進展

庹 磊，李蘇卿，汪春梅(綜述)，曹秀峰(審校)

(南京醫科大學附屬南京醫院腫瘤外科，南京 210006)

全球腫瘤統計顯示，2008年全球新發惡性腫瘤約為1270萬例，惡性腫瘤致死約為760萬例[1]。近幾十年來，國內外腫瘤相關研究已在多個領域取得了一系列成果，但腫瘤的確切發病機制仍在研究探索之中。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)是一類具有調控功能的非編碼RNA，由Okazaki等[2]在小鼠全長cDNA文庫中首次發現，但其一度被認為是基因組的“轉錄噪音”，不具備任何生物學功能[3]。新近研究發現，LncRNA參與基因的轉錄和翻譯及表觀遺傳等多種生物學過程，其調控作用較微RNA(microRNA，miRNA)更為廣泛和復雜[4]。同源盒(homeobox，HOX)基因轉錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是迄今為止為數不多、功能和機制研究較為明確的LncRNA。該文主要關注HOTAIR在多種腫瘤中表達、功能及機制研究，結合目前本領域的最新研究進展，探討LncRNA在腫瘤發生、發展中的作用。

1 HOTAIR的發現及序列進化

HOTAIR是一種典型的反義LncRNA，也是第一個被發現具有反式轉錄作用的LncRNA。Rinn等[5]對人體11種成纖維細胞中轉錄自HOX基因的非編碼RNA進行了研究，共鑒定了231個LncRNA，在研究位于第12號染色體的HOXC基因座時意外發現了一種特殊的LncRNA，其作用方式與其他LncRNA不同，主要通過反式作用沉默染色質，且編碼該LncRNA的DNA僅一條鏈可以被轉錄，與HOX基因序列亦不在同一條DNA鏈上，故將其命名為HOTAIR。

He等[6]研究發現，HOTAIR僅存在于哺乳動物的基因組序列中，全長約2158 nt，位于染色體12q13.13的HOXC11與HOXC12基因之間，共含6個外顯子，包括5個短外顯子及1個長外顯子，進一步研究發現，HOTAIR進化過程顯著快于鄰近的HOX基因，且同源HOTAIR基因外顯子存在不同的進化特征，HOTAIR基因序列保真度比較低，但結構具有高度保守性，長外顯子6的B結構域尤為保守，提示其可能為HOTAIR的核心功能區域。

2 HOTAIR的功能機制

多梳抑制復合體2(polycomb repressive complex 2，PRC2)主要由果蠅zeste基因增強子人同源體2、zeste12抑制子及外性梳蛋白基因組成。EZH2作為PRC2催化亞基，通過其組蛋白甲基轉移酶中高度保守SET結構域{由最早發現表達此結構域的3個基因命名[7]：Su(var)3-9、Enhancer of zeste[E(z)]、Trithorax(trx)}催化H3組蛋白27位賴氨酸三甲基化進而沉默特定基因的轉錄，在染色體水平調控基因活性。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶 1(lysine specific demethylase 1，LSD1)屬于胺氧化酶家族成員，與共阻遏蛋白(Co-repressor of REST，CoREST)形成復合體，而CoREST類似于橋接作用將LSD1與神經元基因沉默轉錄因子(RE1-silencing transcription factor，REST)連接在一起，形成LSD1/CoREST/REST復合體，介導H3組蛋白第4位賴氨酸去甲基化進而調控靶基因的轉錄活性。Tsai等[8]探討了HOTAIR、PRC2和LSD1三者間的關系，結果表明，HOTAIR具有特異性雙向結合的能力，即5′端結構域與PRC2復合體結合，同時其3′端結構域與LSD1/REST/CoREST復合體結合，HOTAIR又可作為腳支架引導PRC2和LSD1形成復合體，并介導該復合物至特定的基因組位點，使該染色體H3組蛋白27位賴氨酸三甲基化及H3組蛋白第4位賴氨酸去甲基化，從而使染色體處于封閉狀態，繼而使其相應下游基因沉默。進一步研究顯示[8]，與HOTAIR結合的PRC2功能區域映射于HOTAIR的1～300核苷酸，而LSD1映射于HOTAIR的1500～2146核苷酸。生物信息學分析及RNA印跡技術證實，PRC2和LSD1與HOTAIR結合的結構域具有廣泛不同的二級結構，HOTAIR存在兩個獨立的結合位點(PRC2及LSD1)，在PRC2及LSD1之間起著“橋梁”作用，進一步證實HOTAIR對PRC2與LSD1之間的相互作用是必需的。LSD1和PRC2已被證實對多數基因的轉錄具有重要的調控作用，因此HOTAIR表達水平的改變極有可能引起復雜的生物學級聯效應。

3 HOTAIR與腫瘤的關系

目前已發現LncRNA在多種腫瘤中差異性表達，而HOTAIR的研究相對比較深入。眾多研究證實，HOTAIR在乳腺癌[9]、食管癌[10]等多種實體腫瘤中均高表達，且與腫瘤細胞侵襲轉移、腫瘤復發及預后不良等均密切相關。

3.1HOTAIR與乳腺癌 Gupta等[9]首先證實，H0TAIR在原發性與轉移性乳腺癌組織中均顯著高表達，且轉移灶中HOTAIR表達水平高出正常上皮組織200～2000倍；進一步體外實驗顯示，過表達HOTAIR能夠促進多種乳腺癌細胞的侵襲和轉移能力，反之，沉默內源性HOTAIR表達，則可顯著抑制腫瘤細胞的侵襲力，提示HOTAIR高表達可能是引起乳腺癌轉移的重要原因；而體內研究揭示，靜脈注射過表達HOTAIR細胞，使肺轉移率較對照組細胞高10倍，并證實過表達HOTAIR可促使原本低轉移活性的SK-BR3細胞向肺臟大量轉移，進一步證實了H0TAIR表達與乳腺癌轉移緊密相關。Bhan等[11]研究發現，雌二醇可誘導HOTAIR轉錄，表明HOTAIR轉錄啟動子區域存在雌二醇多功能反應元件，此機制有助于解釋高表達HOTAIR及乳腺癌進展。以上研究表明，HOTAIR不僅可作為臨床潛在的乳腺癌患者術后轉移預測指標及是否進行輔助放化療的參考指標，其對腫瘤細胞生長及凋亡的調控作用也提示可針對此靶點開發新的腫瘤特異性單抗藥物。

3.2HOTAIR與食管癌 前期研究采用熒光定量聚合酶鏈反應檢測了78例食管鱗癌及正常組織，發現HOTAIR的表達水平在癌組織中普遍高于癌旁組織，HOTAIR高表達與食管鱗癌轉移、臨床TNM分期及總體生存率均緊密相關，且多因素分析顯示與TNM分期及淋巴結轉移相比，HOTAIR是獨立的預后因子；進一步體外實驗證實，HOTAIR在食管鱗癌細胞系中KYSE30細胞株的表達水平最高，采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術敲降HOTAIR，可顯著降低KYSE30細胞的侵襲和轉移能力，并顯著增加細胞凋亡率，證實HOTAIR不僅參與食管鱗癌的發生、發展，而且其在腫瘤轉移及預后判斷中所體現出來的獨特價值提示其極有可能是潛在的新藥作用及治療靶點，為食管癌患者的治療帶來新的希望[10]。

3.3HOTAIR與肝癌 Yang等[12]研究發現，HOTAIR在肝癌組織中高表達，其高表達水平也是肝癌肝移植患者監測術后復發的獨立預后因子，并且在超出米蘭標準的患者中，高表達HOTAIR患者的無復發生存時間更短；體外實驗發現，以siRNA敲降肝癌細胞系中HOTAIR表達可明顯降低細胞生存、侵襲及致敏腫瘤壞死因子α誘導的凋亡，也可顯著增加肝癌細胞對化療藥物順鉑和多柔比星的敏感性。另一項研究發現，HOTAIR缺失可減緩細胞增殖，降低間質金屬蛋白酶及血管內皮生長因子蛋白的表達，這對細胞侵襲及轉移功能非常重要[13]。以上研究表明，HOTAIR的表達水平不僅與肝癌患者術后的預后評估相關，而且與肝癌患者對鉑類制劑和多柔比星的耐藥性及肝癌細胞侵襲轉移功能均密切相關，因此研究HOTAIR確切的功能也有助于臨床解決肝癌患者術后的預后評估、腫瘤復發及化療耐藥等問題。

3.4HOTAIR與胰腺癌 Kim等[14]研究顯示，HOTAIR在胰腺腫瘤組織中高表達，且其表達水平與腫瘤侵襲及轉移呈正相關，同時高表達HOTAIR患者的總體生存較差，以siRNA技術敲降HOTAIR，則可降低細胞系(Panc1及L3.6pL)增殖能力，減緩周期進程，降低侵襲能力及增加細胞凋亡；裸鼠成瘤實驗顯示，敲降HOTAIR可抑制裸鼠腫瘤的生長，表明HOTAIR在胰腺癌進展中發揮抗增殖的作用；進一步采用免疫共沉淀法顯示，HOTAIR介導的基因抑制既有PRC2依賴性也有非PRC2依賴性，即HOTAIR至少存在兩個功能區域，這與Tsai等[8]的研究結果相吻合。

3.5HOTAIR與肺癌 Nakagawa等[15]研究顯示，HOTAIR表達水平與非小細胞肺癌的臨床分期、淋巴結轉移或淋巴血管侵襲及無病生存呈正相關，且過表達HOTAIR可誘導細胞系A549的侵襲及增殖。Liu等[16]研究證實，HOTAIR在非小細胞肺癌組織中高表達，且高表達水平與其進展期病理分期及淋巴結轉移相關，高表達HOTAIR的患者預后相對較差。體外實驗顯示，以siRNA 敲降可降低癌細胞侵襲、遷移能力，而在體內則可抑制細胞轉移，同時，敲降或過表達HOTAIR均可引起HOXA5的表達水平，即HOTAIR可能通過調控HOXA5發揮致癌基因的作用[16]。另一項研究發現,HOTAIR在順鉑抵抗型肺腺癌細胞系中顯著性高表達，而在順鉑敏感的肺腺癌組織中低表達，且其低表達水平與p21呈負相關；體內及體外實驗顯示，以siRNA敲降HOTAIR可使肺腺癌細胞對順鉑再次敏感，反之過表達HOTAIR可降低細胞對順鉑的敏感性；研究還發現,以siRNA敲降HOTAIR可抑制細胞增殖，誘導細胞周期G1期阻滯及增加凋亡，另外過表達或敲降p21可產生類似于敲降或過表達HOTAIR后肺腺癌細胞系對順鉑產生的敏感性效應，而且敲降或過表達p21可補救敲降或過表達HOTAIR對p21及順鉑產生的效應，表明HOTAIR的生物學功能與p21調控通路相關[17]。

3.6HOTAIR與其他腫瘤 Li等[18]研究了HOTAIR與喉鱗狀細胞癌之間的關系，熒光定量聚合酶鏈反應結果證實HOTAIR在喉鱗狀細胞癌組織中顯著性高表達，且其表達水平與預后呈顯著負相關，進一步體外實驗顯示，以siRNA敲降HOTAIR可減少細胞株Hep-2侵襲，而增加細胞凋亡，研究還發現細胞株Hep-2內HOTAIR缺失則細胞PTEN甲基化顯著性降低。Nie等[19]研究結果顯示，HOTAIR在鼻咽癌組織中也呈高表達，較正常組織高5.2～48.4倍，且其表達水平與臨床分期呈正相關，而與總生存率及預后呈負相關，體外實驗顯示HOTAIR表達可影響鼻咽癌細胞遷移、侵襲及增殖能力。Kogo等[20]研究HOTAIR表達與結腸癌的關系，表明HOTAIR在癌組織中顯著性高表達，且其表達水平與肝轉移及結腸癌術后的預后評估緊密相關，而且高表達HOTAIR患者預后更差。Niinuma等[21]研究發現，胃腸間質瘤中HOTAIR及miR-196a均高表達，且表達水平與風險分級、侵襲轉移能力及生存率相關，進一步以siRNA敲低HOTAIR，則可抑制胃腸間質瘤細胞侵襲能力，說明HOTAIR不僅與上皮來源腫瘤的轉移和侵襲能力相關，而且還與間質瘤的侵襲相關，這項研究拓寬了HOTAIR介導腫瘤轉移的范圍，提示HOTAIR在調控腫瘤的轉移中具有普遍意義，也表明HOTAIR與miRNA存在一定關系，共同參與基因表達調控。

4 小 結

目前，越來越多的LncRNA被鑒定，但LncRNA的功能及機制尚未明確。新近研究發現，部分LncRNA可作為內源性競爭性RNA與某些靶miRNA競爭性結合，從而解除miRNA對靶信使RNA的抑制作用，進而發揮特定的生物學功能[22]。Cesana等[23]報道，LncRNA-MD1以“海綿機制”吸附miR-133與miR-135，進而調控轉錄因子Mastermind樣蛋白1和肌細胞特異性增強因子2C表達，從而活化肌肉特定基因的表達，影響肌肉分化。Wang等[24]在肝癌組織中證實，肝細胞癌上調LncRNA可與miR-372競爭性結合，上調miR-372靶基因cAMP依賴性蛋白激酶激動劑β的表達，促使腫瘤細胞持續存活。HOTAIR若能與某個或某類miRNA競爭性結合，進而發揮特定的生物學功能，則不僅揭示HOTAIR全新的作用機制，豐富ncRNA-蛋白質調控網絡，而且可能為探索腫瘤發生、發展的分子機制帶來新線索，為篩查臨床腫瘤、制訂個體化治療方案、監測腫瘤復發及評估預后提供可靠的依據。

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