支氣管哮喘動物模型建立及研究現狀

陳一平(綜述)，李超乾(審校)

(廣西醫科大學第一附屬醫院呼吸內科,南寧 530021)

支氣管哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。近年來隨著生活方式改變及環境因素的影響，特別是在發達國家，哮喘發病、防治成本及疾病負擔有逐年增高的趨勢，據WHO最新報告，目前約有2.35億人受哮喘疾病影響[1]，因此哮喘的相關研究越來越受到醫學界的重視和關注。哮喘發病機制復雜，鑒于人體試驗的局限性，有關哮喘發病機制的探索、新治療方法的評價、新藥研究與開發都主要依賴于動物實驗。隨著動物模型研究的進步和基因敲除及轉基因等技術的出現，使模型動物的選擇和動物模型的建立方法逐步改進以達到盡可能模擬人類哮喘疾病過程的目的，下面就支氣管哮喘的動物模型的建立進展進行綜述。

1 小 鼠

其免疫遺傳背景清楚，品系純，來源廣，相關生物學試劑及抗體易獲得。可復制產生與人類相似的氣道高反應、氣道慢性炎癥、黏液增多等癥狀,并已有反應氣道慢性炎癥過程的氣道重構模型,雖然有體積小、操作及取材較困難，制作往往需要多次致敏和激發等缺點，目前仍為支氣管哮喘研究最為常用的動物模型。常用的小鼠品系為BALB/c、C57BL/6，A/J、CBA、C3H等，以前兩種品系最常用。

1.1BALB/c小鼠 起源于小家鼠Mus musculus，1920年在紐約誕生，至今在全球研究機構繁衍了超過200代，廣泛用于免疫學、生理學的動物實驗，也是目前研究支氣管哮喘的主要實驗動物。實驗中常常選用6～8周齡，體質量18～22 g的雌性小鼠。對于不同種類的哮喘模型，在制備方法上也有所差異，下面就以BALB/c小鼠為重點，分別闡述各類哮喘模型的建立進展。

1.1.1變態反應性哮喘

1.1.1.1卵清蛋白(ovalbumin，OVA)誘發的支氣管哮喘模型 卵清蛋白因其免疫原性強、獲得方便，價格便宜成為目前研究最多、應用最廣、技術也最成熟的誘喘劑，并常與佐劑合用建模，常用佐劑有氫氧化鋁、明礬、百日咳桿菌、抗酸桿菌、內毒素等。目前最常用的造模方法是：第0天、第14天腹腔或皮下注射OVA致敏液0.2 mL/只(含OVA 100 μg)致敏，第21天開始連續霧化吸入5%OVA激發，1次/d，30 min/次，連續霧化7 d以誘發哮喘。目前，在OVA的應用劑量上湛孝東等[2]實驗表明低濃度(10 mg/L)的OVA連續致敏小鼠造成過敏性哮喘病理改變較為明顯，高濃度(1000 mg/L)會導致模型免疫耐受。在激發方法上沈璐等[3]發現滴鼻激發建立的哮喘模型氣道炎癥及氣道反應性升高更為顯著。在氣道炎癥和氣道高反應性的研究上，謝佳星[4]發現平均中位直徑2.9 μm的霧化顆粒激發的小鼠的氣道反應性明顯高于平均中位直徑8.6 μm的霧化顆粒激發的小鼠，但在氣道炎癥表現上無明顯差異，提示建立哮喘模型時注意變應原的大小，并可以利用變應原大小的不同建立具有明顯的嗜酸性粒細胞氣道炎癥、但無氣道高反應性的BALB/c小鼠模型。

1.1.1.2花粉誘發的支氣管哮喘模型 季節性哮喘的誘因中花粉和真菌占很大比例，建立此類模型對研究變應性哮喘有很大意義。李雅莉等[5]應用葎草花粉粗浸液致敏激發的BALB/c小鼠建模，具體方法為：腹腔注射300 μg葎草花粉粗浸液加氫氧化鋁凝膠2 mg致敏，之后第7、14天后加強致敏，方法與劑量同上。第24天給予30μL(10 g/L)葎草花粉粗浸液滴鼻激發，每日1次，連續5次激發。王勝昱等[6]研究了在100、200、300 μg劑量下藜草花粉粗制變應原腹腔致敏與滴鼻激發誘導的小鼠變態反應氣管炎癥動物模型，發現劑量越高，癥狀及實驗室指標越明顯，病死率也越高。

1.1.1.3有機粉塵誘發的支氣管哮喘模型 有機粉塵種類眾多，應用于誘發的支氣管哮喘模型研究較多的是屋塵螨及蟑螂。最近國外相關屋塵螨所致哮喘模型的建立方法都是以鼻內滴入屋塵螨3～6周[7-8]，朱艷芬等[9]研究了不同濃度致敏激發下小鼠支氣管哮喘氣道重構模型存在明顯劑量效應關系及時效關系，結果顯示高濃度屋塵螨提取物9周時氣道重構表現最為明顯。

1.1.2感染性哮喘 采用比較多的是呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virues，RSV),內毒素脂多糖等。蔣雄斌等[10]研究表明，RSV感染可致OVA致敏激發的哮喘小鼠呼吸道炎癥明顯加重，呼吸道反應性顯著增加，且氣道高反應性持續時間明顯延長。張雷英等[11]研究了感染時期對哮喘模型的影響，致敏前感染RSV明顯抑制OVA誘導的肺炎癥，RSV/OVA組小鼠肺組織內炎性細胞浸潤顯著減輕，但致敏后感染RSV則對OVA誘發的氣道變態炎癥無明顯影響。Newcomb等[12]則發現IL-17A基因敲除的小鼠比野生小鼠在經OVA及RSV致敏激發的過程中表現出了更強烈的氣道高反應性和氣道炎癥癥狀。

1.1.3職業性哮喘 此類哮喘多為工作人員在生產環境中反復接觸有機酸酐所致，隨著全球工業化進程的加快，逐步得到國際上中、美、英、德、日等國家重視。職業性哮喘的動物模型多以小分子半抗原致敏。這組化合物包括鄰苯二甲酸酐、偏苯三酸酐(trimellitic anhydride，TMA)、六氫鄰苯二甲酸酐等，模型建立主要以大鼠及豚鼠為主。甲醛近年來在室內污染研究中越來越受到重視，劉丹丹[13]發現雖然單獨的氣態甲醛致敏激發小鼠只能產生呼吸道嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)比率增加，不能誘發典型哮喘癥狀，但可以以類似佐劑的作用加重哮喘小鼠模型癥狀。

1.2C57BL/6小鼠 源于艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株,1921年誕生，1985年引入中國。實驗小鼠多選用鼠齡4～8周，體質量在18～22 g之間，性別選擇要求不嚴，但為避免雄性小鼠為爭奪交配權而造成實驗動物的浪費，多數研究還是選擇雌性小鼠。國內黃華瓊等[14]分別研究了5周齡開始致敏9周齡激發、5周齡開始致敏49周齡激發、45齡致敏49周齡激發的3組C57BL/6小鼠,發現早期致敏有利于哮喘模型的建立，致敏和激發的時間可影響炎癥的嚴重程度。同時，早致敏晚激發的方法可獲得穩定的EOS炎癥、黏液高分泌和氣道高反應的變化。Bogaert等[15]應用OVA及弗氏佐劑致敏建立了長久以來被忽視或誤解的中性粒細胞性哮喘小鼠模型。Corry等[16]在1996年就曾經在研究中應用OVA采取皮內注射致敏、霧化吸入激發的方式成功建立了C57BL_6小鼠的哮喘模型，并發現了C57BL_6小鼠在氣道反應性變化上不如balb_c小鼠。因此目前C57BL_6小鼠哮喘模型的應用遠比不上balb_c小鼠，少數應用OVA建立C57BL_6小鼠哮喘模型的研究方法都與balb_c小鼠類似，這里不再贅述。

由于C57BL_6小鼠對塵螨和豚草抗原反應性較強，故在有機粉塵誘發的哮喘模型研究中應用較多。常用造模方法：在實驗第1天腹腔加皮下注射致敏劑50μL/只，第7天腹腔注射致敏劑50 μL。于第15～18天，用塵螨粗提浸液50μL/d，一次性緩慢滴鼻激發。在致敏方式的研究上，孔存權等[17]比較不同致敏方式在相同激發下的結果，發現塵螨粗提浸液可以單獨應用建立哮喘模型，但就穩定性和成功率而言，加用佐劑或OVA更好。陳華夏[18]應用了基因敲除技術建立模型動物，發現CXCR34基因敲除小鼠經粉塵螨提取液致敏并激發的哮喘模型較野生C57BL_6小鼠模型肺部炎癥應答更加嚴重。

2 大 鼠

大鼠品系純，來源廣，價格較便宜，有關分子生物學試劑較多，標本采集量較充足，對抗原反應性較為一致，能出現與人類哮喘類似的速發相及遲發相變態反應，用大鼠制作哮喘動物模型的技術也較成熟，大鼠基因組與人的基因組序列較為相似，大鼠體內很多酶存在基因互補的抗體及探針，可以使對這些酶進行的量化及定位研究更為直接，因而大鼠哮喘模型應用也較多，國內以Wistar大鼠、SD(Sprague Dawly)大鼠，BN(BrownNorway)大鼠為主。

2.1Wistar大鼠 1907年由美國wistar研究所育成。多選擇鼠齡6～8周，體質量(200±50) g，常用造模方法為：即第1天及第7天將單只大鼠腹腔注射1% OVA 1 mg(含l%氫氧化鋁凝膠及6×106/L百日咳滅活菌苗混合液1 mL)致敏，第15天開始霧化吸入2%OVA，連續7 d。魯燕霞[19]觀察了幼年(斷奶21 d)大鼠給予連續7 d束縛應激及成年(9周)大鼠給予連續21 d束縛應激后常規造模，提示心理應激能加重Wistar大鼠哮喘模型氣道炎癥表現。喬永康[20]研究了甲醛(formaldehyde，FA)在大鼠哮喘模型中的作用，結果表明0.5 mg/m3和3.0 mg/m3的氣態FA暴露易化或惡化OVA誘導型哮喘。對于單獨應用3.0 mg/m3FA組，一方面該組FA暴露可誘發實驗大鼠持續的氣道高反應性，另一方面高濃度FA單獨暴露可能通過激活Th1類免疫反應和非EOS炎癥而誘發氣道高反應性等哮喘樣癥狀。

2.2SD大鼠 1925年，美國斯潑累格·多雷(Sprague Dawley)農場用Wistar大鼠培育而成。實驗模型多選雄性SD大鼠，鼠齡6～8周，體質量(200±20) g，常用造模方法為：大鼠則行OVA腹腔內注射給藥，每隔7天1次，從第16天開始大鼠進行霧化吸入1% OVA，每次霧化30 min,共連續10 d吸入；張婷[21]在腹腔注射OVA致敏后以滴鼻和霧化的方法分別建立上下氣道炎性反應。龔萍等[22]對比了不同方式哮喘激發發現，泵霧化激發方式優于傳統的超聲霧化激發方式。SD大鼠是研究職業性哮喘的常用模型動物，馮里[23]改進了以往的造模方法：d1致敏：在大鼠背部兩側分4點皮內注射0.15 mL含50%TMA的AOO(丙酮∶橄欖油=4∶1，體積比)溶液；d8致敏：兩耳背各皮下注射0.075 mL含25%TMA的AOO溶液；后6周每周1次霧化含TMA 60 mg的霧化液激發15 min，成功建立哮喘模型。同時對比研究了鄰苯二甲酸酐引發哮喘的比例不及TMA。

2.3BN大鼠 1930年Wistar研究所的King在野外捕獲的野生大鼠，并由King和Aptekman維持繁育，其中一個大鼠品系發生褐色突變，1958年Silvers和Billingham利用它們進行兄妹交配并進行組織相容性選擇后獲得。相較于前兩種品系的大鼠，BN大鼠應用相對較少。實驗模型多選SPF級雄性SD大鼠，體質量200 g左右，目前常用為：d1皮下注射含OVA 100 μg、5×108個滅活百日咳桿菌疫苗和氫氧化鋁凝膠的生理鹽水混懸液1 mL，14 d后以5%的OVA生理鹽水溶液5 L/min霧化吸入5 min，激發哮喘發作，連續3次，每次間隔5 d[24]。

3 豚 鼠

豚鼠哮喘模型是最早及最經典的動物哮喘模型，在1976年就有應用OAV建立豚鼠哮喘模型的報道[25]，后來隨著研究的深入文獻報道很多，Ressmeyer等[26]也認為豚鼠在氣道藥理模型上比大鼠及小鼠更合適。因為用于豚鼠的檢測試劑不多，尤其是抗體部分，這就限制了研究工作的開展。而且豚鼠敏感性強，個體反應差異大，對于致敏原不反應或明顯反應甚至死亡，影響造模成功率，且實驗動物相對于小鼠和大鼠而言較為昂貴，會導致研究成本的增加，故近年來豚鼠用于支氣管哮喘建模有逐步減少的趨勢。試驗豚鼠多數研究選擇雄性豚鼠，鼠齡25～35 d，體質量(200±50) g，造模方法一般為：實驗第1天腹腔注射10%的OVA1 mL，2周后把豚鼠置于密閉的玻璃霧化罩內以l%的OVA霧化誘喘，每日1次直至哮喘典型癥狀出現。李海銀等[27]應用OVA聯合弗氏佐劑致敏豚鼠建立了中性粒細胞哮喘的豚鼠模型。

4 其他哮喘模型動物

除目前常用的大鼠、小鼠、豚鼠外還有一些相對大型的動物可以選擇，例如貓可發生類似于人類慢性哮喘的支氣管疾病；馬可以形成以中性粒細胞升高為主的呼吸道疾病，它有哮喘的一些特點，可能與慢性阻塞性肺疾病的聯系更加密切；已知羊和犬對某些變應原天生就敏感[28]，猴的免疫系統和人非常相似，但是存在動物來源及實驗成本的限制，研究與應用都相對較少。

5 結 語

雖然目前支氣管哮喘的動物模型可選的實驗動物越來越多，針對不同誘因的哮喘建立模型的方法越來越完善，建立的動物模型都出現了典型行為學表現，肺病理切片中的各種細胞、BALF中細胞計數、分類、EOS比率及相關生理功能指標等都符合哮喘的疾病特征，但目前仍沒有哪種模型可以完全模擬人類哮喘的疾病過程，所以為了弄清楚哮喘的發病機制并最終能更好的預防和治療支氣管哮喘，仍需在實驗動物模型的建立上更加努力。

[1] Seo JW,Cho SC,Park SJ,etal.1′-Acetoxychavicol Acetate Isolated from Alpinia galanga Ameliorates Ovalbumin-Induced Asthma in Mice[J].PLoS One,2013,8(2):e56447.

[2] 湛孝東，姜玉新，李良懌，等.不同濃度卵蛋白變應原對小鼠哮喘模型建立的影響[J].中國實驗動物學報,2012,20(4):16-20.

[3] 沈璐，賴克方，姜華，等.不同激發方式對小鼠過敏性支氣管哮喘模型的影響[J].國際呼吸雜志,2009,29(15):909-913.

[4] 謝佳星.呼吸道高反應性發生條件及機制的探討[D].廣州：廣州醫學院,2009.

[5] 李雅莉，張明，盧家美，等.葎草花粉致敏的小鼠肺部變應性炎癥模型的建立[J].西安交通大學學報：醫學版,2010,31(5):562-565.

[6] 王勝昱，孫秀珍，盧家美，等.藜草花粉特異性致敏哮喘動物模型的制備[J].陜西醫學雜志,2010,39(9):1113-1116.

[7] Fredriksson K,Fielhaber J A,Lam J K,etal.Paradoxical effects of rapamycin on experimental house dust mite-induced asthma[J].PLoS One,2012,7(5):e33984.

[8] Ward MD,Chung YJ,Copeland LB,etal.Allergic responses induced by a fungal biopesticide metarhizium anisopliae and house dust mite are compared in a mouse model[J].J Toxicol,2011,2011:360805.

[9] 朱艷芬，宋澤慶，林璘.支氣管哮喘小鼠呼吸道重構模型的構建及評價[J].吉林大學學報：醫學版,2010,36(1):99-103.

[10] 蔣雄斌，殷凱生，朱毅.呼吸道合胞病毒感染對卵白蛋白誘導的哮喘小鼠呼吸道高反應動態變化的影響[C]//中華醫學會第六次全國哮喘學術會議暨中國哮喘聯盟第二次大會.中華醫學會第六次全國哮喘學術會議暨中國哮喘聯盟第二次大會論文匯編.蘇州:中華醫學會呼吸病學分會,2008:88-94.

[11] 張雷英，吳建奇，劉靜，等.γδ T細胞參與呼吸道合胞病毒感染對呼吸道變態炎性反應的影響作用[J].中華微生物學和免疫學雜志,2012,32(3):234-238.

[12] Newcomb DC,Boswell MG,Reiss S,etal.IL-17A inhibits airway reactivity induced by respiratory syncytial virus infection during allergic airway inflammation[J].Thorax,2013,68(8):717-723.

[13] 劉丹丹.氣態甲醛暴露對卵清蛋白免疫的Balb/c小鼠哮喘發生的影響[D].武漢：華中師范大學,2010.

[14] 黃華瓊，王嬌莉，葉颯，等.不同致敏和激發時間對哮喘模型的影響[J].中國病理生理雜志,2008,24(11):2285-2288.

[15] Bogaert P,Naessens T,De Koker S,etal.Inflammatory signatures for eosinophilic vs.neutrophilic allergic pulmonary inflammation reveal critical regulatory checkpoints[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2011,300(5):L679-L690.

[16] Corry DB,Folkesson HG,Warnock ML,etal.Interleukin 4,but not interleukin 5 or eosinophils,is required in a murine model of acute airway hyperreactivity[J].J Exp Med,1996,183(1):109-117.

[17] 孔存權，彭霞，白萍，等.塵螨粗提浸液致敏小鼠的方法學研究[J].國際檢驗醫學雜志,2010,31(6):528-530.

[18] 陳華夏.粉塵螨提取液致敏CXCR3基因剔除小鼠肺部變應性炎癥的研究[D].北京：北京協和醫學院 清華大學醫學部,2009.

[19] 魯燕霞.幼年心理應激對支氣管哮喘大鼠中樞與外周免疫功能的影響[D].濟南 山東大學,2010.

[20] 喬永康.甲醛誘導型哮喘大鼠模型的建立及其機理研究[D].武漢:華中師范大學,2008.

[21] 張婷.樹突狀細胞與上下呼吸道炎性反應一致性研究[D].瀘州:瀘州醫學院,2012.

[22] 龔萍.大鼠哮喘模型的改良與評價[D].長沙:中南大學,2009.

[23] 馮里.三拗湯及類方對TMA致哮喘模型大鼠作用、作用機理及物質基礎研究[D].南京:南京中醫藥大學,2009.

[24] Venkatesan N,Siddiqui S,Jo T,etal.Allergen-induced airway remodeling in brown norway rats:structural and metabolic changes in glycosaminoglycans[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2012,46(1):96-105.

[25] Muller E,Bergmann KC,Lachmann B,etal[Experimental model of bronchial asthma (author′s transl)][J].Z Erkr Atmungsorgane,1976,144(3):246-253.

[26] Ressmeyer AR,Larsson AK,Vollmer E,etal.Characterisation of guinea pig precision-cut lung slices:comparison with human tissues[J].Eur Respir J,2006,28(3):603-611.

[27] 李海銀，朱黎明，戴愛國，等.豚鼠中性粒細胞性哮喘模型的建立[J/CD].中華哮喘雜志：電子版,2012,06(4):245-249.

[28] Padrid P.Chronic lower airway disease in the dog and cat[J].Probl Vet Med,1992,4(2):320-344.