一氧化碳與移植器官缺血/再灌注損傷

張金敏，張松林(綜述)，魏 蕾(審校)

(1.三峽大學心血管病研究所 宜昌市中心人民醫院心胸外科，湖北 宜昌 443003; 2.武漢大學醫學院病理生理教研室，武漢 430071)

缺血/再灌注損傷是臨床器官移植最常見的病理過程，是導致同種移植物術后早期功能不全的主要原因和晚期并發癥(如移植物血管病變)的主要相關因素[1]。尤其在目前供體不足的情況下，較多的利用受到不同程度的損傷甚至是非心跳的供體器官，更易受到缺血/再灌注損傷的影響。因此，尋找一種有效的減輕缺血/再灌注損傷的治療方法是移植領域研究的方向之一。Smith等[2]在1992年意外發現以一氧化碳(carbon monoxide,CO)中毒患者為供體來源的心臟移植，術后排斥反應輕，移植物功能較好。由于CO的毒性，直到后來發現源于血紅素加氧酶(heme oxygenase,HO)催化亞鐵血紅素降解產生的內源性CO，它的生理作用才得到重視。CO是一種與一氧化氮類似的氣體信號分子，在調節血管張力、細胞生長與應急等方面發揮關鍵性作用。近年來，有學者把外源性CO用于器官移植研究，發現其與HO-1有類似的作用，可以明顯減輕器官移植物缺血/再灌注損傷，并探明了部分機制。

1 CO具有改善微循環的作用

微循環紊亂是器官移植物缺血/再灌注損傷的特征性表現之一。移植物冷保存期間的缺血缺氧導致血管內皮通透性和黏附分子表達的增加，內皮細胞失去其抗黏附的特性并形成易于黏附的表面。移植恢復血流后，缺血受損的內皮細胞黏附血小板和白細胞，釋放細胞因子和縮血管物質，進一步加劇炎性反應和內皮細胞的通透性，增加血管阻力而導致微循環紊亂[3]。研究表明，CO可以通過保護血管內皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)、調節血管張力和抗凝作用來改善器官移植物缺血/再灌注損傷后的微循環紊亂[3]。

1.1CO保護VECs VECs是缺血/再灌注損傷的主要作用靶區，其損傷可導致器官移植物的微循環紊亂和炎癥級聯反應的激活。在形態學上，冷保存再灌注后損傷的VECs表現為移植物內毛細血管內皮細胞標志物CD31的表達明顯減少，并出現不規則和中斷現象；掃描電鏡顯示VECs有較多空泡形成和線粒體的破壞；而受體吸入CO組(250×10-6kg/L)卻發現毛細血管CD31著色的VECs呈線型排列，細胞間的結構保存完好；透射電鏡三維顯像示毛細血管呈網絡狀排列和較好的充盈狀態，近似正常組織的超微結構[4-5]。這提示CO可以通過保存VECs的形態結構完整性來減輕移植物缺血/再灌注損傷。

資料表明，損傷的VECs可以上調黏附分子的表達，如細胞黏附分子1、血管細胞黏附分子1、P選擇素等，從而促進VECs與白細胞和血小板的黏附，導致微循環的紊亂和移植物損傷[3]。因此，抑制黏附分子的表達將有助于緩解移植物缺血/再灌注損傷。這在大鼠腎移植與肺移植實驗中得到證實，吸入CO可以顯著降低再灌注后移植物內細胞黏附分子1 mRNA的表達[4-5]，減少白細胞的黏附和浸潤。

在體外細胞培養的實驗中，同樣證實了CO對VECs的保護性影響。Brouard等[6]的研究顯示，外源性CO(10000×10-6kg/L)明顯阻止腫瘤壞死因子α誘導的VECs凋亡，其保護機制與p38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)的活化有關，使用p38 MAPK抑制劑(SB203580)可以逆轉CO的保護性影響[6]；Caumartin等[7]亦證實，CO釋放分子2預處理人臍靜脈內皮細胞，可以明顯減輕其缺氧/再氧化損傷，并證實與CO的抗炎作用有關。

1.2CO調節血管張力 微循環紊亂的另一特點是移植物缺血或再灌注后血管灌注壓明顯升高。損傷的VECs釋放縮血管物質內皮縮血管肽1，導致血管阻力增加。研究表明，CO可以抑制人肺動脈VECs和血管平滑肌細胞內皮縮血管肽1的表達[6]。動物實驗中，受體吸入CO(250 ×10-6kg/L)可以明顯阻止心臟移植后內皮縮血管肽1的激活，并改善移植物功能[8]。這證實了CO可以通過抑制縮血管物質的表達而發揮其擴血管功能。

此外，可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)的活化及其伴隨的環鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)產生在CO調節血管張力中起關鍵作用。cGMP可以激活其下游的cGMP效應蛋白，如蛋白激酶，從而導致血管平滑肌松弛。由于外源性CO可以明顯提高細胞內cGMP的濃度，可以認為CO的舒血管功能至少部分是cGMP依賴性的。在肺、腎移植的動物實驗中，受體給入CO(250×10-6kg/L)或CO釋放分子預處理可以明顯改善移植物內的血流[3,9]，而CO的這種有益影響可以被sGC的選擇性抑制劑所逆轉，這間接地證實sGC/cGMP途徑介導了CO的舒血管作用。

1.3CO具有抗凝作用 血小板在器官移植物缺血/再灌注損傷的發病機制起重要作用，它激活后可以分泌促凝物質(如血栓素A2)，導致微循環內血細胞黏附、纖維素沉積和血栓形成。CO具有強大的抗凝功能，能抑制血小板釋放血栓素。在熱缺血/再灌注肺損傷模型中，吸入CO明顯抑制纖溶酶原活化因子抑制劑1的表達，減少微血管內的纖維素沉積[10-11]。Mishra等[11]在大鼠同系肺移植實驗中觀察到，CO不僅能減少纖維素和白細胞沉積，還明顯抑制細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的活性和促凝激活劑早期生長反應因子1的表達。但抑制sGC的活性可以抵消CO的這種保護性影響，提示CO的抗凝功能也可能是經sGC/cGMP途徑介導的[10-11]。此外，CO也可經激活糖蛋白Ibα介導的機制抑制血小板凝集和白細胞黏附，從而改善微循環。

2 CO具有強大的抗炎癥特性

炎癥免疫反應是器官移植物缺血/再灌注損傷的最主要的特征。損傷的組織細胞釋放促炎細胞因子、趨化因子、黏附分子和各種酶類物質，移植物內伴有中性粒細胞、巨噬細胞甚至T淋巴細胞浸潤。已經證明，CO對各種損傷均具有抗炎作用[3]。CO不僅可以保護脂多糖誘導的組織炎癥損傷和下調眾多促炎因子的表達(如腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β、白細胞介素6等)，且對移植物缺血/再灌注損傷也顯示出強大的抗炎功能。在一系列的動物移植模型中，受體在移植前1 h和移植后24 h持續吸入低濃度的CO(250×10-6kg/L)，可以明顯減輕冷保存再灌注后腎、心臟、肺和肝臟移植物內的炎性細胞浸潤[7,9,12-15]。其機制與CO下調促炎介質(如腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β、白細胞介素6、誘生型一氧化氮合酶、環氧合酶2等)的表達密切相關。

另有研究表明，核因子κB作為參與炎性反應的一個重要信號轉導分子，調節許多炎癥基因的表達，在誘導不同的器官移植物缺血/再灌注炎癥損傷中起重要作用[3]。在肝、肺移植動物研究中，均發現核因子κB在移植血流恢復后迅速激活，而CO可以明顯減少炎性因子的表達和減輕移植物的損傷程度，但核因子κB的活性無明顯變化[3,5,10]。相反的是，低濃度CO能抑制脂多糖誘導的巨噬細胞粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的產生，其機制與CO抑制核因子κB的激活有關[16]。因此，核因子κB途徑是否介導了CO對器官移植物缺血/再灌注炎癥損傷的保護性影響，目前仍有爭議。

此外，MAPK可能是移植物缺血/再灌注炎癥損傷的另一重要信號轉導途徑。MAPK主要包括p38MAPK、ERK、c-Jun氨基端激酶三個家族，與多種炎癥性疾病有關。研究顯示，CO的抗炎特性與MAPK激活有關，如CO能選擇性地激活p38MAPK和其上游的MAPK激酶，從而保護人肺上皮細胞的氧化損傷[6]。在大鼠同系肺、肝臟移植模型中，冷保存再灌注后移植物內MAPK的三種激酶明顯激活，吸入低濃度CO[(20～250)×10-6kg/L]明顯改善移植肺的氧合功能，下調促炎細胞因子的表達，且證實CO的這種保護性影響與抑制ERK1/2的激活有關[10,15]，而CO并未抑制p38MAPK或c-Jun氨基端激酶的活性。

3 CO抑制樹突狀細胞的成熟與遷徙

近年來的研究表明，樹突狀細胞(dendritic cell，DC)在缺血/再灌注損傷中也起重要作用。損傷細胞釋放內源性配體與DC上的Toll樣受體結合，通過一系列蛋白質級聯反應，導致促炎性細胞因子的釋放，如白細胞介素12、干擾素γ、白細胞介素6和腫瘤壞死因子α等，從而損傷缺血/再灌注器官。目前，在移植背景中探討CO與DC關系的研究極少。Kotsch等[17]在一組同種大鼠腎移植研究中，用CO的前體藥物二氯甲烷預處理供體，移植后與對照組比較，發現受體脾臟主要組織相容性抗原Ⅱ、CD80、CD86等分子的表達明顯減少，同時趨化因子干擾素誘導蛋白10的表達亦顯著減少，而移植物內上述分子無明顯變化。這提示CO預處理供體可以抑制移植物DC的成熟和遷徙，降低移植物的免疫原性，減輕器官移植物的缺血/再灌注損傷。但CO調節DC的具體機制仍有待闡明。

4 CO具有抗凋亡作用

凋亡是器官移植物冷保存再灌注后常見的病理生理現象。業已證明，抑制細胞死亡信號通路是阻止器官移植物缺血/再灌注損傷的重要策略[3]，而凋亡細胞死亡又是促發炎癥和組織損傷的關鍵因素，這提示凋亡在移植物缺血/再灌注損傷和功能不全中起重要作用。

前已述及，CO可以通過激活p38MAPK抑制腫瘤壞死因子α誘導的VECs凋亡[6]。在移植背景中，CO可以經不同的信號機制，同樣顯示出抗凋亡功能。Neto等[4]在大鼠腎冷保存24 h后移植的模型中發現，胱天蛋白酶3(caspase-3)陽性著色主要位于腎小管上皮細胞和管腔的細胞或碎片，移植后6 h陽性著色細胞數達最多，而受體吸入CO(250×10-6kg/L)則明顯減少腎小管caspase-3陽性細胞的凋亡數(峰值<50%)。同樣，在器官保存液中加入CO釋放分子3，能明顯抑制低溫誘導的腎小球和腎小管細胞凋亡，并改善移植腎臟功能，其抗凋亡功能與CO穩定線粒體膜有關[18-19]。此外，采用二氯甲烷誘導受體小鼠產生CO，發現能明顯減輕移植誘導的缺血/再灌注損傷，移植心臟再灌注后凋亡細胞明顯減少，并證實CO的這種保護性影響與抑制促凋亡基因Bcl-2 mRNA和caspase-3的表達有關[20]。

目前，CO的抗凋亡影響在細胞模型和在體動物中均得到證實。但是，它對器官移植物缺血/再灌注損傷的保護作用是否主要通過抑制細胞凋亡實現的，目前仍不清楚。因此，關于凋亡在缺血/再灌注損傷中的具體作用以及CO在缺血/再灌注損傷中抗凋亡的信號機制，都有待于深入研究。

5 小 結

在各種動物移植模型的研究中，CO可通過改善微循環、抗炎作用、抑制DC成熟與遷徙、抑制凋亡等機制，明顯減輕器官移植物缺血/再灌注損傷。此外，CO可應用于邊緣性供體、已切除的移植物及受體，符合獨特的移植環境，是最有希望用于臨床移植的方法之一。但目前臨床應用CO的研究較少，且部分結果與動物實驗研究結果并不一致，這可能與外源性CO作用的不同模型、持續時間、吸入濃度以及作用的靶組織和靶細胞的差異性有關。此外，尚需進一步研究CO保護器官移植物相關機制并深入探討CO的毒性、藥動學及其生物學功能，以利于把這些研究成果應用于臨床。

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