肝癌細胞起源的研究現狀

龐業濱，黎樂群，彭寧福(綜述)，向邦德(審校)

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽外科，南寧530021)

根據最新的流行病學調查結果，原發性肝癌已成為全球第5位最常見的惡性腫瘤，病死率排名第3位[1]。在中國，原發性肝癌年發病率居全部腫瘤第2位，病死率僅次于肺癌居第2位[2]。原發性肝癌中絕大部分(>85%)屬于肝細胞癌[3]。肝細胞癌惡性程度高，早期診斷率低，容易擴散轉移，術后易復發，對于晚期肝細胞癌患者，放療及化療的效果十分有限，影響肝癌患者預后的主要因素仍是就診時腫瘤的分期分級[4]。自從Bonnet等[5]首次于人類急性粒細胞白血病中分離出腫瘤干細胞樣細胞群，之后在乳腺癌、前列腺癌等實體瘤中成功分離出腫瘤干細胞，研究者發現腫瘤干細胞與腫瘤的形成、發展、轉移及復發、耐藥有著很大的相關性。隨著研究的深入，研究者開始探討這一功能上與組織干細胞十分相似的細胞類型，本質上是否就是由組織干細胞突變而來[6]。這些研究成果使得人們不禁產生這樣的疑問：對于原發性肝癌，以往的研究是否都過多關注成為“結果”的腫瘤細胞，而忽略了作為“原因”的腫瘤干細胞。

1 腫瘤的細胞起源學說

關于腫瘤的細胞起源，目前有兩種主流的觀點。①一種觀點認為腫瘤起源于成熟的組織細胞，由成熟細胞去分化成為幼稚細胞，重新獲得自我更新的能力，進而突變形成腫瘤細胞。Friedmann等[7]發現，在大鼠中由致癌基因的突變而引起神經元和星形膠質細胞的去分化會導致神經膠質瘤的形成。Lazarevich等[8]通過重排肝細胞核因子(一種維持肝細胞穩定性的因子)的基因序列，導致肝細胞的去分化、增殖并形成人與大鼠的肝細胞癌。②另一種觀點則認為腫瘤起源于組織中正常的干細胞，由干細胞的分化成熟受阻，再演變成腫瘤細胞。早在2001年，Reya等[6]在總結了前人研究結果的基礎上，提出“腫瘤干細胞”學說，認為腫瘤干細胞是腫瘤內可能存在的具有增殖、自我更新能力和多向分化潛能的干細胞樣細胞，是腫瘤形成的起始細胞，并認為腫瘤干細胞是正常干細胞累積突變的結果，是由正常干細胞轉化而來。Sell[9]認為更有理由相信腫瘤起源于正常干細胞，依據主要是：①干細胞具有自我更新和分化能力，經常處于增殖狀態，因此較成熟細胞更易受到攻擊而發生突變；②干細胞壽命較長，有更多機會受到多次攻擊，并且有累積突變的條件，而形成腫瘤。時至今日，研究者已在眾多實體瘤(如腦腫瘤、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌)中相繼證實有腫瘤干細胞的存在[10]，同時不斷有文獻報道認為腫瘤的產生與正常干細胞突變有著密切的聯系。而對于腫瘤干細胞與正常干細胞的關系，Reya等[6]認為兩者有很多相似的特性：①干細胞和腫瘤干細胞均有自我更新及無限增殖能力；②干細胞和腫瘤干細胞有相同的信號轉導通路，如Wnt-β聯蛋白通路、Notch通路、Sonic hedgehog通路等信號通路；③干細胞和腫瘤干細胞具有端粒酶活性。但是，Marquardt等[11]認為腫瘤干細胞有自己的特性，并不完全等同于正常干細胞：①腫瘤干細胞自我更新能力的負反饋機制已被破壞，其增殖分化處于無序和失控的不平衡狀態；②腫瘤干細胞缺乏正常干細胞那樣的分化成熟能力；③腫瘤干細胞具有積累復制錯誤的傾向，而正常干細胞通過多種途徑防止這種情況發生；④腫瘤干細胞有耐受遺傳毒性藥物及形成腫瘤的能力。根據現有的證據，肝癌起源的干細胞成熟受阻學說目前得到較多數學者的認可。

2 肝癌的干細胞起源

2.1肝干細胞 在成體肝臟組織中，肝干細胞主要有肝內源性和外源性兩種來源。肝內來源主要是指位于肝內膽管最小末端的卵原細胞，是目前較為公認的肝臟干細胞。卵原細胞具有雙向分化潛能，在肝實質細胞受到嚴重損傷，同時分裂增殖能力被阻抑的情況下，從休眠狀態中活化，分化成肝實質細胞及膽管細胞，完成肝臟的結構及功能的重建。Furuyama等[12]通過對大鼠體內表達轉錄因子Sox9細胞的譜系追蹤，證實了大鼠肝臟起始細胞定位于末梢膽管上皮。Yoon等[13]則證實在人類成體肝臟中存在著相似的肝臟起始細胞。肝外來源肝干細胞主要有血液循環中的骨髓干細胞，以及少部分胰腺上皮細胞。Liu等[14]研究發現，骨髓干細胞可在肝臟損傷或是細胞因子的趨化作用下，移行至肝臟匯管區，并在特定環境下分化成肝實質細胞及膽管上皮細胞。肝內及肝外來源的肝干細胞解剖上均定位于膽管上皮細胞和肝細胞的移行處，也即是膽管系統的末梢—Hering管及其周圍。

2.2肝干細胞與肝癌發生密切相關 在肝硬化等被認為是肝癌癌前病變的慢性肝病中，通常會出現卵原細胞的增殖，提示肝臟干細胞與肝癌癌變有關。Lowes等[15]發現酒精性肝病、慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌等組織中均有卵原細胞出現，且隨著病情程度加重而增多；在此基礎上，Galicia等[16]最新的研究發現，在人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)同源基因(注：PTEN基因和p53基因類似，是作用較為廣泛的抑癌基因，在多種腫瘤中均有出現，公認簡稱為PTEN基因)抑癌基因缺失的動物模型中，是肝臟慢性炎癥階段促使了原始腫瘤起始細胞(tumor initial stem cell,TISC)的產生，而非PTEN基因缺失本身。最近2年，基因功能分析技術及分子病因學研究方面的進展，使得人們對于肝干細胞在肝癌發生、發展過程中的變化有了更本質的認識。在肝癌發生早期，轉化生長因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)信號途徑通過中間蛋白SMAD(drosophila mothers against decapentaplegic protein)，激活細胞分化程序并抑制細胞周期循環。研究者發現，在促進分化及生長停滯的信號途徑中，一些中間調節因子(如β2-Spectrin)的丟失，將會導致肝干細胞的惡性轉化并形成肝癌，而在肝癌的TISC細胞群中，TGF-β促分化信號的丟失，會導致TISC內高表達胚胎干細胞轉錄因子Oct4和Nanog，同時賦予TISC自我更新的能力[17]。經典的β聯蛋白信號途徑是通過激活T細胞因子/淋巴增強因子啟動子起作用，而這也是正常干細胞增殖、存活及抑制分化的機制。β聯蛋白信號途徑及其相關蛋白的變異則通常指β聯蛋白的激活，但是Wnt途徑未被啟動，這一現象多在因慢性肝損傷而代償性增殖的肝干細胞中發現，并最終導致肝癌的發生[18]。在一份最新的研究報告中，來自中國上海東方肝膽外科醫院的Wu等[19]將大鼠干細胞樣多能細胞——WB-F344細胞暴露于低劑量TGF-β下處理18周，發現TGF-β長期處理削弱了WB-F344細胞的干細胞潛能，卻賦予了其腫瘤起始細胞的特性，包括表達TISC的標志物、自我更新能力及藥物抗性的增加，以及對非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷(Non-obese diabetic/severe combined immunodeficient,NOD/SCID)大鼠的致瘤性。研究最后認為，TGF-β可誘導硬化肝的干細胞樣細胞惡性轉化為TISC細胞，并通過依賴miR-216a/PTEN/Akt途徑促進肝癌發生。歸結起來，基因功能分析已確認的使肝干細胞發生轉變的信號途徑包括：有絲分裂原激活的蛋白激酶，磷脂酰肌醇磷酸激酶，TGF-β和β聯蛋白途徑，轉化為TISC后高表達多能相關性轉錄因子，包括Nanog、Oct4、c-Myc和Sox2等[11]。由此推斷，肝干細胞的自我更新失調控有可能是肝癌形成的早期事件，肝癌的發生與肝干細胞密切相關。

3 肝癌干細胞(肝癌起始細胞)的分離鑒定

迄今為止，還未能在肝癌組織中分離出真正意義上的肝癌干細胞。在分離鑒定肝癌干細胞方面，使用較多的方法是，以一些被認為是肝干細胞表面標志物的細胞表面抗原特異性標記細胞后進行分離。CD133，又稱為Prominin-1，是一種跨膜糖蛋白，最初發現于神經上皮干細胞，CD133的表達已在多個人類肝癌細胞系中得到證實[20]。最近的研究表明TGF-β信號途徑在機制上調控著CD133在Huh7細胞系中的表觀遺傳修飾，且CD133的表達水平被認為與肝癌起始有關[21]；上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)在新生肝臟組織及膽管系統中高表達，在成熟肝細胞中不表達，并且TISC信號途徑β聯蛋白的激活可使EpCAM的表達上調[22]，據此可以作為肝臟干細胞與腫瘤干細胞相互聯系的佐證，其表達與患者預后有關[13]；CD44屬于黏附分子家族，在肝癌中CD44的表達與腫瘤細胞的浸潤、轉移及化療耐藥有關[23]。除此之外，CD90也是報道了較多在肝癌組織中高表達的干細胞標志物[24]。由于這些標志物在肝癌細胞系中的表達率從1%～60%不等[23]，因此結合多個標志物的共表達對肝癌干細胞的篩選將更為特異。肝癌組織中高表達上述標志物的細胞較其他腫瘤細胞有更強的體外成瘤能力、更強的侵襲性、更高的耐藥性和轉移復發能力，并且擁有自我更新及增殖分化的能力。

此外，在肝癌組織中還分離出一種被稱為側群(side population,SP)細胞的腫瘤細胞。SP細胞由于細胞膜上存在腺苷三磷酸結合盒，能夠將熒光染料Hoechst 33342轉移出細胞外而被識別，這一特性也被成為SP表型。Chiba等[25]通過免疫組織化學技術發現SP細胞同時擁有肝細胞及膽管細胞表型，并且SP細胞與非SP細胞相比，表現出高增殖潛能和抗凋亡能力、高度的自我增殖和體外成瘤能力，1×103個側群細胞即可使NOD/SCID大鼠成瘤，而非側群細胞1×106個仍不能使NOD/SCID大鼠成瘤，據此認為SP細胞可能聚集了大部分甚至全部的肝癌干細胞。但并不是所有具有SP表型的細胞均有干細胞特性，也不是所有腫瘤干細胞都有SP表型。Lichtenauer等[26]對腎上腺皮質癌細胞系NCI-h295R的研究，以及Burkert等[27]對胃腸道癌的研究均證實，這些癌組織中的SP細胞不具有干細胞特性。Hill等[28]的研究認為，用于SP分選的Hoechst 33342染料具有細胞毒性，SP細胞由于腺苷三磷酸結合盒的轉運作用而免受毒害，而非SP細胞則沒有這層細胞膜上的保護性蛋白，不能存活，因此SP細胞的致瘤性可能是Hoechst 33342染料的毒性而人為導致的。

4 結語與展望

隨著對肝腫瘤干細胞研究的不斷深入，不斷有證據支持肝癌起源于干細胞，同時也表明肝癌組織中確實存在肝癌干細胞。但是，肝癌的干細胞起源學說還面臨著許多未解的難題，例如干細胞在演變為肝癌過程中經歷了哪些基因變化，具體的信號轉導通路如何都還未得到詳細闡明。因此，對肝干細胞癌變機制的探討，將揭示其在肝癌發生、發展和轉移，以及耐藥和復發過程中的作用，為研究肝癌新的診斷治療方法提供理論依據。

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