骨髓間充質干細胞誘導分化為心肌樣細胞的鑒定指標

馬新喆，張娟娟，呂 洋(綜述)，王海萍(審校)

(河北北方學院組織學與胚胎學教研室，河北 張家口 075000)

近些年來，心血管疾病越來越引起人們的重視，隨著生活節奏的加快，死于心血管疾病的人數日益增加，心肌梗死、心力衰竭等成為常見病。心肌細胞是終末分化細胞[1-2]。現有的醫療水平和治療方法無法從根本上修復壞死的心肌細胞，如何改善心肌功能，提高心肌效率，從細胞水平上預防和治療疾病，成為一項重要的課題。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有向心肌分化的潛能，使得BMSCs成為細胞移植治療心肌損傷最有前途的細胞來源之一[3-4]。誘導BMSCs分化為心肌細胞成為國內外該領域的研究熱點。目前已發現多種誘導劑能作用于BMSCs使其分化為心肌樣細胞[5-6]。本文對研究BMSCs誘導分化為心肌樣細胞的檢測指標進行綜述。

1 結蛋白與α肌動蛋白

結蛋白與α肌動蛋白作為心肌細胞分化的早期標志已經得到了公認，是目前用來特異性檢測心肌細胞應用次數最多也是最普遍的指標。結蛋白是最早表達于未分化的肌母細胞中的肌源性蛋白，在肌源性細胞發育、成熟的過程中起重要作用，能夠維持肌纖維形態，連接細胞核與細胞膜，從而使肌小節之間發生信號聯系。α肌動蛋白是肌動蛋白的一種亞型，是骨骼肌和心肌中具有特異性收縮功能的細胞骨架蛋白，為胎兒或新生兒心室肌的主要成分。指導α肌動蛋白組織特異性表達的是α肌動蛋白啟動子。α肌動蛋白啟動子是心肌細胞高表達的強啟動子，在心肌細胞或心肌組織中高效表達，在其啟動子區域有轉錄因子的特定結合序列，表達受轉錄因子的調控。Klug等[7]采用人類α肌動蛋白啟動子來篩選純化人類胚胎干細胞分化的心肌細胞，得到了99%純的心肌細胞。

結蛋白和α肌動蛋白的表達陽性說明BMSCs發生了肌源性分化。華聲瑜等[8]通過研究丹酚酸B對大鼠BMSCs分化過程中結蛋白、α肌動蛋白信使RNA表達的影響的結果顯示，5-氮胞苷組和5-氮胞苷+丹酚酸B組各樣本中均出現明確的心肌早期分化基因；與5-氮胞苷組相比，5-氮胞苷+丹酚酸B組的結蛋白和α肌動蛋白信使RNA的表達顯著增加，中藥單體丹酚酸B對BMSCs向心肌細胞的分化具有一定的誘導或促進作用。

2 肌鈣蛋白

肌鈣蛋白是一種調節蛋白，分子呈球形，包括三個亞單位：肌鈣蛋白I是抑制亞單位，可抑制肌球蛋白與肌動蛋白結合，阻止肌肉收縮；肌鈣蛋白C是鈣離子受體，與Ca2+結合，活化細肌絲，相對分子質量為18×103；肌鈣蛋白T能將肌鈣蛋白附著在原肌球蛋白上，使原肌球蛋白與肌鈣蛋白結合成原肌球蛋白-肌鈣蛋白復合物，并附著在肌動蛋白雙股螺旋狀的縱溝內[9]。肌肉的調節由Ca2+介導，影響到肌動蛋白、甲胎蛋白酶的活性與肌球蛋白結合的效果。

肌鈣蛋白I為單一多肽鏈，其相對分子質量隨各亞型不同而異。肌鈣蛋白I有三種亞型，由不同的基因編碼，分別定位于骨骼肌快肌、慢肌以及心肌中。心肌肌鈣蛋白I(cardiac-specific troponin I，cTnI)以兩種形式存在于心肌細胞內：小部分(約3%)游離于胞質中，為可溶性；大部分以結構蛋白的形式固定于肌原纖維上，為不可溶性。正常人血液中cTnI的水平一般<0.3 μg/L，當肌細胞受到損傷時，游離的cTnI先釋放入血，隨著損傷加重，結合部分的cTnI被降解從而不斷釋放入血，導致血中cTnI持續升高。研究表明，成人的骨骼肌組織在任何階段中都不表達cTnI，也不因任何病理刺激表達肌鈣蛋白[10]。所以，cTnI有較高的心肌特異性，是檢測心肌損傷和鑒定心肌源性細胞的特異性生化標志物，其表達陽性可以說明BMSCs發生心肌轉化。張宇等[11]研究發現，通過免疫組織化學染色的方法檢測到實驗組胞質內出現棕黃色顆粒狀復合物，呈陽性表達，而對照組呈弱陽性或陰性，從而確定5-氮胞苷能夠誘導BMSCs向心肌細胞轉化。

3 間隙連接蛋白43

心肌細胞的縫隙連接是心臟電生理一致性的物質結構基礎。間隙連接蛋白43(connexin-43，Cx43)主要存在于心房和心室肌細胞連接處，在正常心臟組織細胞中表達。Cx43參與細胞間縫隙連接，是分化細胞與宿主細胞形成興奮收縮耦聯同步的蛋白質基礎。Cx43基因DNA長約2768 bp，其中開放讀碼框為1146 bp，編碼378個氨基酸的單肽，因其相對分子質量約為43×103，故命名為Cx43。Cx43是心肌細胞縫隙連接的特征性蛋白，其表達陽性說明心肌間閏盤的形成[12]。Cx43對于細胞間化學信息的交流和電沖動的傳導，維持電活動和機械收縮、舒張功能的同步性，以及心肌功能的保持非常重要，是目前檢測心肌閏盤的常用指標。賈敏等[13]在研究BMSCs分離培養及向心肌細胞轉化的過程中，通過免疫細胞化學染色發現cTnT和Cx43表達陽性，說明分化的細胞具有心肌細胞特性。

4 肌細胞增強子2

肌細胞增強子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)屬于轉錄調節因子MADS-Box家族，是一種特定的轉錄因子。在脊椎動物中，MEF2家族的轉錄因子有四個成員，分別是MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D。MEF2蛋白的結構分為N端和C端，其N端在不同物種中幾乎相同，都含有一個MADS-Box結構域和一個直接與其相鄰的MEF2結構域。MADS-Box是由57個氨基酸組成的DNA結構域，不同脊椎動物中具有高度保守性。MEF2結構域由MADS-Box附近的29個氨基酸組成，是MEF2因子所特有的結構域[14]。MEF2C在心臟發育中表達，并且作為心臟特異性的轉錄因子參與心臟發育的各個過程，調節心臟特異性基因的表達。MEF2C與其他成員相比，其表達組織特異性比較顯著。

5 心臟轉錄因子GATA結合蛋白4

GATA是一種組織特異性表達的轉錄因子家族。脊椎動物有6個GATA轉錄因子，其中心肌轉錄因子GATA-4在心臟發育最早期表達，是調控心肌基因表達的重要轉錄因子，參與了心臟正常發育、功能基因表達和心肌肥大的病理過程，是心肌前體細胞最早的標志之一。人類GATA-4基因是一類含有鋅指結構的組織特異性表達的轉錄因子，能結合共同序列(A/T)GATA(A/G)。GATA-4位于人類染色體8p23.1～p22，總長度為55 757 bp，有7個外顯子，cDNA全長3372 bp，編碼序列全長1329 bp。文通等[15]研究發現，BMSCs轉染microRNA-1后，心肌重要轉錄因子GATA-4和MEF2C表達逐漸上調，轉染后6 d，心肌特異性蛋白cTnI表達呈陽性，結果表明，microRNA-1能誘導BMSCs向心肌樣細胞分化。

6 心肌早期轉錄因子Csx/Nkx2.5

Csx/Nkx2.5是背側中胚層形成所必需的，它在心肌開始分化前即開始表達，是所有脊椎動物心臟發生中最早表達的轉錄因子，即心臟前體細胞最早的標志物。隨著對心臟發育機制和相關信號通路研究的深入，人們發現MEF2C、Csx/Nkx2.5和GATA-4等轉錄因子可以作為心臟細胞分化過程中特異性的標志[16]。Vincentz等[17]的研究證實，Nkx2.5是心肌發育過程中起決定性作用的基因，MEF2C與Nkx2.5之間的相互作用對心臟(尤其是心室)發育至關重要。

伍長學等[18]的研究結果驗證了電學因素在心臟發育過程中具有重要意義的理論假設,該實驗結果顯示，在各時間點5-氮胞苷誘導+電刺激組GATA-4、NKx2.5 和MEF2C基因表達量顯著高于單純5-氮胞苷誘導組，且兩組的表達規律相似；通過蛋白定量分析發現，在各個時間點前組肌鈣蛋白I、結蛋白、Cx43顯著高于后組，通過這種對應關系，推測GTAT-4、NKx2.5和MEF2C基因參與調控心肌細胞的形成過程，而電刺激通過上調GATA-4、NKx2.5和MEF2C基因的表達，進而促進肌鈣蛋白I、結蛋白和Cx43蛋白的表達和心肌細胞的形成。

7 超極化激活的核酸環化酶門控的離子通道

心肌組織的節律性活動(如心跳、呼吸等)均依賴于其中所含的一種能產生起搏電流的起搏細胞，這種電流最初由Di Francesco在20世紀80年代初研究兔竇房結起搏活動時發現，并稱之為特種離子流。在此之前，Noma和Irisawa已經在研究竇房結起搏活動時發現這一離子流并命名為過渡激活正離子流，現稱為超極化激活及環化核苷酸門控陽離子通道(hyperpolarization activated,cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)[19]。HCN所具有的超極化激活鈉鉀離子通道、細胞內環腺苷酸的調節及微弱的單通道電導等被認為是起搏活動所必須的獨特特征，稱為起搏電流[19]。在脊椎動物，HCN家族中包含4個成員，即HCN1、HCN2、HCN3、HCN4。HCN4基因位于人染色體15q23～q24上，全長共5065 bp，含有8個外顯子，相對分子質量為129.1×103[20]。HCN基因家族中不同亞型的基本序列60%大體一致。HCN3特征性地僅在中樞中表達。HCN4基因的編碼產物HCN4蛋白由1203個氨基酸組成，包含了6個跨膜部分(S1～S6)。HCN1、HCN2和HCN4在心臟中表達豐富，而根據原位雜交分析HCN的表達在竇房結中依次為HCN4>HCN2>HCN1。因此，可以通過檢測HCN4、HCN2和起搏電流判定BMSCs分化為心肌細胞。

8 肌球蛋白重鏈

已知哺乳動物的心臟表達兩種肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)，即α-MHC和β-MHC，這些基因表達產物在肌球蛋白分子中形成二聚體，存在3種分子異構體，即Vl(A-A同二聚體)、V2(A-B異二聚體)、V3(B-B同二聚體)。MHC具有兩個生物學作用：一是具有腺苷三磷酸酶活性，裂解腺苷三磷酸，能夠有效地將高能磷酸化合物分解釋放的化學能轉變成動能；二是具有與肌動蛋白結合的能力[21]。α-MHC見于胚胎型心肌細胞，而β-MHC在成熟心肌細胞中表達。β-MHC蛋白水平能夠在一定程度上反映BMSCs向心肌細胞的分化情況，其基因表達水平是觀察BMSCs向成熟心肌樣細胞分化的重要指標之一[22]。冼紹祥等[23]在研究三七總皂苷對BMSCs增殖和向心肌樣細胞分化的影響的實驗中，分別檢測正常大鼠心肌細胞和誘導前、誘導后4周細胞的α-MHC和β-MHC信使RNA的表達，發現經三七總皂苷、5-氮胞苷誘導24 h后繼續培養，BMSCs能表達α-MHC 和β-MHC。

9 小 結

作為判定BMSCs誘導分化為心肌樣細胞的檢測指標結蛋白，α肌動蛋白、肌鈣蛋白、Cx43、GATA-4等已經得到普遍應用，隨著這些檢測指標的應用，為BMSCs誘導分化為心肌樣細胞提供了理論支持。然而BMSCs分化為心肌樣細胞仍存在如何更好分離和純化BMSCs、最佳誘導劑的選擇、臨床應用的安全性以及如何提高誘導分化率等問題。隨著更多誘導劑的發現以及更有效的心肌特異性檢測指標的研究，BMSCs誘導分化為心肌樣細胞的前景會越來越廣闊，干細胞移植將會給更多心腦血管疾病的患者帶來福音。

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