茶多酚改性膠原蛋白-殼聚糖復合膜工藝優化

陳達佳，趙 利*，袁美蘭，蘇 偉，劉 華，溫慧芳

（江西科技師范大學生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發分中心，江西 南昌 330013）

茶多酚改性膠原蛋白-殼聚糖復合膜工藝優化

陳達佳，趙 利*，袁美蘭，蘇 偉，劉 華，溫慧芳

（江西科技師范大學生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發分中心，江西 南昌 330013）

以鮰魚皮膠原蛋白與殼聚糖為原料制備可食用復合膜，用茶多酚進行改性。通過正交試驗，考察茶多酚添加量、熱處理溫度和熱處理時間對復合膜性能的影響，以期降低復合膜的水蒸氣透過率和增強復合膜的機械性能。結果表明：茶多酚添加量、熱處理溫度、熱處理時間對復合膜的性能影響顯著。最佳改性條件為：茶多酚添加量2%、熱處理溫度80 ℃、熱處理時間30 min。在此條件下，得到的復合膜拉伸強度為（29.39±0.96） MPa，斷裂伸長率為（84.22±0.05）%，水蒸氣透過率為（0.20±0.01） （g·mm）/（h·m2·kPa），溶解度為（32.06±1.23）%，透光率為（82.4±1.10）%。

茶多酚；膠原蛋白；殼聚糖；改性；復合膜

在過去10 a中，一種可再生、可降解的天然聚合物在食品包裝膜的應用上引起了廣泛的興趣。然而用這些天然聚合物做成的可食用膜并不能完全取代合成聚合膜[1-2]，原因是可食用膜與合成聚合膜（如低密度聚乙烯膜、高密度聚乙烯膜）相比，其拉伸強度低，水蒸氣透過率高[3-4]。針對可食用膜的缺點，可食用膜改良劑逐漸被研究出來，使得可食用膜在一些應用上仍然有潛力代替合成聚合膜。

常見可食用膜的底物主要有蛋白質、多糖、脂質及它們之間的混合物[5-7]。可食用膜可以被微生物所降解或與被包裝食品一起食用，也可以作為添加劑的載體，例如抗菌劑、抗氧化劑、維生素、芳香物質及色素等[8-11]。此外可以用來制作可食用膜的天然聚合物（如膠原蛋白、殼聚糖）都可以從工業下腳料中獲得。

蛋白質和多糖具有親水性，由這些高分子做成的可食用膜能有效的阻隔氧氣、二氧化碳、香味、油脂等，但與合成聚合物相比，它們的一些性能（如高水蒸氣透過率、低機械性能）限制了其應用[12]。因此，可食用膜常常需要改性，常用改性的方法有化學改性、物理改性和酶法改性。化學改性、物理改性和酶法改性分別是通過使用交聯劑戊二醛、γ射線和轉谷氨酰胺酶交聯聚合物鏈改變聚合物網絡結構，從而提高可食用膜的性能。化學改性法常用戊二醛，但戊二醛不僅有細胞毒性而且容易引起組織鈣化，物理改性（超聲波、γ射線）和酶法改性（轉谷氨酰胺酶）成本太高[13]。

茶多酚是多酚結構的天然產物，具有能夠形成穩定的氫鍵結構的潛能。Madhan等[14]研究了茶多酚對膠原蛋白穩定性的作用，經過茶多酚處理后的膠原蛋白熱收縮溫度可提高10 ℃。茶多酚價格便宜，常被廣泛用作于天然抗氧化劑。在臨床應用和作為食品添加劑，被證明是安全的，其無毒性己經在老鼠實驗中得到證明[15]。可見茶多酚是一種新型高效、安全的天然交聯劑。本研究旨在利用茶多酚改性膠原蛋白-殼聚糖復合膜，以期增強其機械性質、降低水蒸氣透過率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膠原蛋白由農業部淡水魚加工技術研發分中心（南昌）提供[16]；殼聚糖 北京索萊寶科技有限公司；茶多酚 西亞試劑公司；甘油、冰乙酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

CT3 質構儀 美國Brookfield公司；N-1100旋轉蒸發儀 東京理化器械公司；79HW-1恒溫磁力攪拌器江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；烘箱 上海一恒科學儀器有限公司；UV-1100紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復合膜的制備

將殼聚糖溶于2%的乙酸溶液中，加熱攪拌后得到質量分數為2%的殼聚糖溶液。用0.5mol/L的乙酸提取鮰魚皮中的膠原蛋白3 g，取一定量旋轉蒸發濃縮至質量分數為6.67%。

將上述膠原蛋白溶液與殼聚糖溶液按質量比6∶4混合，加入占總溶質質量分數20%的甘油，然后加入一定量的茶多酚，在一定溫度條件下加熱攪拌一段時間，去除氣泡，流延于聚乙烯盤內，在50 ℃條件下干燥24 h，移出后揭膜，將膜置于盛有飽和Mg(NO3)2·6H2O溶液的干燥器中，25 ℃條件下，保持相對濕度（50±3）%，48 h后測定膜的各項性能指標。

1.3.2 機械性能測定

按照Arvanitoyannis等[17]的方法，采用TA-XT2i質構儀測定各膜的抗拉伸強度（tensile strength，TS）和斷裂拉伸率（elongation at break，EAB）。每種膜測定5 個平行樣，每個樣品大小為1.5 cm×8 cm。

拉伸強度指膜在軸向拉伸力作用下，破裂前所承受的最大應力，按式（1）計算：

式中：TS為膜的抗拉伸強度/MPa；F為軸向拉伸力/ N；L為膜的寬度/mm；d為膜的厚度/mm。

斷裂伸長率是評價膜在拉伸測試中破裂時的延伸能力的指標，按式（2）計算：

式中：EAB為斷裂伸長率/%；E為膜樣品在斷裂時所達到的長度/mm；E0為膜的初始長度/mm。

1.3.3 水蒸氣透過率（water vapor permeability，WVP）的測定

采用修正的ASTM[18]方法測定。干燥器底部加入蒸餾水，25 ℃條件下，蒸餾水使干燥器內的相對濕度保持在100%。透濕杯內裝無水氯化鈣，透濕杯上覆蓋待測膜，置于相對濕度為50%的干燥器內，每隔1 h稱量透濕杯的質量。水蒸氣透過率按式（3）計算：

式中：WVP為水蒸氣透過率/（（g·mm）/（h·m2·kPa））；q/t為單位時間內透濕杯增加質量的算術平均值/（g/h）；d為樣品膜厚度/mm；S為樣品膜實驗面積/m2；ΔP為試樣兩側的蒸汽壓/kPa，由于膜兩側的相對濕度梯度為50%、測定溫度為25 ℃，故ΔP為1.58 kPa。

1.3.4 溶解度（solubility，S）的測定

按照Gontard等[19]的方法，將膜樣（2 cm×2 cm）在100 ℃條件下干燥至恒質量，稱質量m1，然后將樣品直接放入盛有50 mL蒸餾水的離心管中，在室溫25 ℃條件下浸泡24h，隔一段時間攪動一下離心管。將沒有溶解的膜取出來，用濾紙吸干表面的水分，在100℃條件下干燥至恒質量，稱質量m2。溶解度按式（4）計算：

式中：m1為膜溶解前干燥后的質量/g；m2為未溶物干燥后的質量/g。

1.3.5 透光率（light transmittance，T）的測定

將待測樣品裁剪成10 mm×50 mm矩形，貼于比色皿內側，采用修正過的ASTM[20]的方法在800 nm波長處測定透光率，以空比色皿作為對照，用透光率大小間接表示膜的透明度。

1.3.6 單因素試驗

1.3.6.1 茶多酚添加量對復合膜性質的影響

膠原蛋白溶液與殼聚糖溶液按質量比6∶4混合，加入20%總溶質的甘油，分別加入1%、2%、3%、4%、5%的茶多酚，在70 ℃條件下加熱攪30 min，按照1.3.1節所述制備復合膜后測定各項指標。

1.3.6.2 熱處理溫度對復合膜性質的影響

膠原蛋白溶液與殼聚糖溶液按質量比6∶4混合，加入20%總溶質的甘油，加入2%的茶多酚，分別在50、60、70、80、90 ℃條件下加熱攪30 min，按照1.3.1節所述制備復合膜后測定各項指標。

1.3.6.3 熱處理時間對復合膜性質的影響

膠原蛋白溶液與殼聚糖溶液按質量比6∶4混合，分別加入20%總溶質的甘油，加入2%的茶多酚，分別在80 ℃條件下加熱攪拌10、30、50、70、90 min，按照1.3.1節所述制備復合膜后測定各項指標。

1.3.7 正交試驗設計及表觀特征評分標準

通過單因素試驗表明，茶多酚添加量、熱處理溫度、熱處理時間對膜的性能均有顯著影響。綜合考慮，茶多酚添加量、熱處理溫度、熱處理時間按照L9（34）進行正交試驗設計見表1，以拉伸強度、斷裂伸長率、水蒸氣透過率為表觀特征評分指標，表觀評分標準公式：評分=A+B+2C（A代表TS表觀特征得分，B代表EAB表觀特征得分，C代表WVP表觀特征評分）。各表觀特征評分標準見表2。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal experiments

表2 復合膜表觀特征評分標準Table 2 Grading criteria for apparent characteristics of the composite film

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 茶多酚添加量對復合膜性質的影響

圖1 茶多酚添加量對復合膜機械性質的影響Fig.1 Effect of tea polyphenol concentration on mechanical properties of film

由圖1可知，復合膜的TS值隨著茶多酚添加量的增加先增加再減小。當茶多酚添加量開始增加時，復合膜的抗拉伸強度增加，在茶多酚的含量為2%時，TS值達到最大的（27.62±0.98）MPa，這可能是由于茶多酚交聯膠原蛋白-殼聚糖，增加了分子間及分子內的氫鍵作用，形成穩定化網絡結構，使得膜更加致密，從而使得復合膜TS值增加。但當茶多酚添加量進一步增加，TS值降低，這可能是由于過高的茶多酚添加量將引起快速反應，在膠原蛋白表面形成聚合物，妨礙膠原蛋白與殼聚糖進行交聯[21]，而且多余的茶多酚不能與膠原蛋白-殼聚糖反應而游離于復合膜中，成顆粒狀，影響膜的網絡結構穩定性，使得膜易撕裂，從而降低了復合膜的TS值。復合膜的EAB值隨著茶多酚添加量增加而減小。當茶多酚含量開始增加，EAB值減小，茶多酚添加量增加到2%和3%時，EAB值分別減小到（88.90±2.43）%和（85.00±2.50）%，這可能是由于茶多酚增加了膠原蛋白分子內和膠原蛋白-殼聚糖分子間的交聯，減小其分子間的距離，使得EAB值降低，這與Bravo[22]結論相反。當茶多酚添加量超過3%時，EAB值顯著降低，這可能是由于多余的茶多酚不能與膠原蛋白-殼聚糖反應而游離于復合膜中，成顆粒狀，影響膜的網絡結構穩定性，使得膜易撕裂。

圖2 茶多酚添加量對復合膜水蒸氣透過率（A）、溶解度（B）、透光率（C）性質的影響Fig.2 Effect of tea polyphenol concentration on WVP (A), S (B), and T (C) properties of film

由圖2A可知，復合膜的WVP值隨著茶多酚添加量的增加而先減小而后顯著增加。當茶多酚添加量開始增加，復合膜WVP值逐漸降低，茶多酚添加量為2%時，WVP值達到最低（0.24±0.01）（g·mm）/（h·m2·kPa），這可能是由于茶多酚增加膠原蛋白分子內和膠原蛋白-殼聚糖分子間的交聯，減小了分子間的距離，使成膜物質之間形成更加緊密的網絡結構，這個網絡結構顯著的減少了水蒸氣的轉移，這與Rao等[23]的結果一致。然而當茶多酚的含量超過2%時WVP值呈上升趨勢，這可能是由于過量的茶多酚不能與膠原蛋白-殼聚糖反應，從而游離于復合膜中，干燥后成顆粒狀凸起，破壞了膜的網絡結構，使得復合膜氣密性下降。

由圖2B可知，復合膜的S值隨著茶多酚添加量的增加而先減小后增加。當茶多酚添加量開始增加，復合膜S先減小，茶多酚添加量為2%時，S值達到最小（35.91±0.75）%，這可能是由于茶多酚的交聯作用使復合膜的網絡結構變得致密，表面疏水性增強，導致在水中穩定性的提高，使得膜不易溶解[24-25]。隨著茶多酚添加量進一步增加，復合膜的S值開始增加，這可能是由于此時茶多酚含量過高，過多的茶多酚成顆粒狀凸起在復合膜中，破壞了復合膜的網絡結構。

由圖2C可知，茶多酚添加量對復合膜在波長為800 nm的透光率有顯著影響，T值隨著茶多酚添加量的增加而顯著減小，這可能是有兩方面原因：一是茶多酚呈棕褐色，隨著含量的增加顏色變深，導致復復合膜顏色變深影響透光率；二是多余的茶多酚在復合膜中成顆粒狀凸起，導致透光率下降。透光率通常也是判斷共混高分子相容性好壞的手段，若共混膜中高分子材料間的相容性較差，則在兩相界面上光的散射或反射將使共混膜的透光率降低[26]。從測試結果可以看出茶多酚添加量為1%和2%時，復合膜在800 nm波長處的透光率較好。

綜上可知，當茶多酚添加量為2%時，復合膜的TS值達到最大，EAB值下降幅度較小，WVP值最低，故選擇茶多酚添加量2%為最佳單因素。

2.1.2 熱處理溫度對復合膜性質的影響

由圖3可知，復合膜的TS值隨著熱處理溫度的升高而先增加后減小。當熱處理溫度開始升高，復合膜的TS值先增加，熱處理溫度為80℃時TS值達到最大為（29.04±0.12）MPa；在熱處理溫度低于80℃時，復合膜的EAB值隨著熱處理溫度的升高而逐漸減小；這可能是由于較高的熱處理溫度有助于提高膠原蛋白與殼聚糖分子的運動速率，加大膠原蛋白分子內以及膠原蛋白與殼聚糖分子間交聯的幾率，增加了兩種分子相互作用的機會，使得相互作用力逐漸增強，形成的復合膜結構趨于致密。當熱處理超過80℃，TS值顯著下降到（9.94±1.20）MPa，復合膜EAB值從（80.05±4.24）%顯著減小到（44.73±2.915）%，這可能是由于此時的加熱溫度過高，導致膠原蛋白與殼聚糖形成的交聯物質變性。

圖4 熱處理溫度對復合膜水蒸氣透過率（A）、溶解度（B）、透光率（C）性質的影響Fig.4 Effect of heat treatment temperature on WVP (A), S (B), and T (C) of film

由圖4A、B可知，復合膜的WVP值和S值隨著熱處理溫度升高而先減小后增加。當熱處理溫度升高到80 ℃時，復合膜的WVP值減小，達到最低（0.21±0.01） （g·mm）/（h·m2·kPa），S值達到最小（32.83±0.75）%，這可能是由于較高的熱處理溫度有助于提高膠原蛋白與殼聚糖分子的運動速率，增加茶多酚交聯兩者的幾率，使得膜結構趨于致密，從而降低水蒸氣透過率和溶解度。當溫度超過80 ℃，WVP值和S值顯著增加，這可能是由于此加熱溫度導致膠原蛋白與殼聚糖形成的交聯物質熱變性。由圖4C可知，熱處理溫度對復合膜在800 nm波長處T值有顯著影響，T值隨著熱處理溫度的升高而顯著增加。

綜上可知，當熱處理溫度為80 ℃時，復合膜的TS值達到最大，EAB值下降幅度較小，WVP值最低，故選擇熱處理溫度為80 ℃為最佳單因素。

2.1.3 熱處理時間對復合膜性質的影響

圖5 熱處理時間對復合膜機械性質的影響Fig.5 Effect of heat treatment time on mechanical properties of film

由圖5可知，復合膜TS值隨著熱處理時間的延長先顯著增加后顯著減小，復合膜的EAB值隨著熱處理時間的延長先顯著減小后緩慢減小。當熱處理時間開始延長，復合膜TS值增加，在熱處理時間為30 min和50 min時，TS值都在29MPa左右，沒有顯著差別；當熱處理時間開始延長，復合膜EAB值顯著減小，處理時間為30 min時EAB值由（105.51±1.67）%減小到（80.05±4.24）%。這可能是由于熱處理時間較短時，膠原蛋白與殼聚糖在較短時間的磁力攪拌作用下分子間相互作用位點增多，有利于茶多酚交聯，使得分子間作用力增強，從而TS值增加。但在熱處理時間進一步延長時，攪拌容易打斷部分已形成的膠原蛋白-殼聚糖交聯結構，從而使得TS值降低。

圖6 熱處理時間對復合膜水蒸氣透過率（A）、溶解度（B）、透光率（C）性質的影響Fig.6 Effect of heat treatment time on WVP (A), S (B), and T (C) of film

由圖6A、B可知，復合膜WVP值和S值隨著熱處理時間的延長而先減小后增加，當熱處理時間為30、50 min和70 min時，WVP值沒有顯著變化，都在0.21 （g·mm）/（h·m2·kPa）左右，S值沒有顯著變化，都在32%左右。這可能是由于膠原蛋白與殼聚糖在較短時間的磁力攪拌作用下分子間相互作用位點增多，有利于茶多酚交聯，使得分子間作用力增強，膜結構更加致密，有利于阻隔水分的遷移，使得膜不易破裂和溶解。當熱處理時間進一步延長時，WVP值沒有顯著的改變，S值顯著增加，這可能是由于攪拌容易打斷部分已形成的膠原蛋白-殼聚糖交聯結構。由圖6C可知，熱處理時間對復合膜在800 nm波長處T值有顯著影響，復合膜T值隨著熱處理時間的延長先顯著增加后顯著減小。

綜上可知，當熱處理時間為30、50 min時，復合膜的TS值和WVP值沒有顯著差別，EAB值相對較好，從節約能源方面選擇熱處理時間30 min為最佳單因素。

2.2 改性復合膜制備工藝優化

2.2.1 正交試驗結果

正交試驗評分結果及正交試驗直觀分析結果分列在表3、4。

表3 正交試驗設計及結果Table 3 The results of orthogonal experiments

由表3可以看出，因素的主次順序從主到次為：熱處理溫度、熱處理時間、茶多酚添加量。最優工藝條件為茶多酚添加量2%、熱處理時間80 ℃、熱處理時間30 min。

2.2.2 驗證實驗

表4 正交試驗驗證結果Table 4 Validation of the optimal conditions obtained by orthogonal experiments

按照正交試驗篩選出的工藝條件茶多酚添加量2%、熱處理時間80 ℃、熱處理時間為30 min進行3 次驗證實驗。由表4可以看出，3 次驗證實驗的結果沒有顯著性差異，TS值（29.39±0.96）MPa、EAB值（84.22±0.05）%、WVP值（0.20±0.01）（g·mm）/（h·m2·kPa）、S值（32.06±1.23）%、T值（82.4±1.10）%，說明篩選出的工藝合理可行，穩定可靠，具有可重復性。

3 結 論

茶多酚改性膠原蛋白-殼聚糖復合膜實驗表明，未改性膜的TS值21.98 MPa、EAB值127.35%、WVP值0.41（g·mm）/（h·m2·kPa），改性膜與之相比拉伸強度增加了33.71%、斷裂伸長率降低了33.86%、水蒸氣透過率降低了51.61%，說明茶多酚能夠增加膠原蛋白-殼聚糖復合膜的分子間的交聯，改善復合膜的特性。機械性能的增加能夠增強可食用膜的物理包裝性能，水蒸氣透過率的降低能夠減少食品與外部環境的水分轉移速率，不僅能減少食品水分的損失，而且能夠減少食品受到外界環境的污染，在此基礎上可望開發出一種具有廣發應用前景的新型可食用膜材料。

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Effect of Tea Polyphenols on Properties of Collagen-Chitosan Based Composite Films

CHEN Da-jia, ZHAO Li*, YUAN Mei-lan, SU Wei, LIU Hua, WEN Hui-fang
(National R&D Branch Center for Conventional Freshwater Fish Processing, School of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China)

The aim of this work was to develop edible composite film based on Amiurus nebulosus skin collagen and chitosan by using tea polyphenols to modify the functional properties of the composite film. Through orthogonal experiments, the effects of technological parameters including the concentration of tea polyphenols, temperature and heating time on film properties were investigated in order to reduce the water vapor transmittance and improve the mechanical properties of the composite film. The results showed that all these three parameters significantly affected the properties of the films. The optimal conditions for modification were achieved by adding 2% tea polyphenols and subsequently heating at 80 ℃ for 30 min. Under these conditions, the tensile strength, elongation at break, water vapor penetration rate, solubility and light transmittance of the composite fil m were (29.39 ± 0.96) MPa, (84.22 ± 0.05)%, (0.20 ± 0.01) (g·mm)/(h·m2·kPa), (32.06 ± 1.23)% and (82.4 ± 1.10)%, respectively.

tea polyphenols; collagen; chitosan; modification; composite film

TS254.4

A

1002-6630（2014）24-0063-06

10.7506/spkx1002-6630-201424012

2014-03-04

江西省現代農業技術體系建設專項資金社會公益研究項目（2060302）

陳達佳（1986—），男，碩士研究生，研究方向為食品化學。E-mail：kjchendajia@163.com

*通信作者：趙利（1967—），女，教授，博士，研究方向為食品化學。E-mail：lizhao618@hotmail.com