凝膠過濾色譜法測定3種不同來源多肽的相對分子質量分布

蔣騰川，宋新波,2,*，張麗娟

（1.天津中醫藥大學研究生院，天津 300193；2.天津中一制藥有限公司，天津 300193）

凝膠過濾色譜法測定3種不同來源多肽的相對分子質量分布

蔣騰川1，宋新波1,2,*，張麗娟1

（1.天津中醫藥大學研究生院，天津 300193；2.天津中一制藥有限公司，天津 300193）

目的：建立凝膠過濾色譜法測定多肽（如大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盤多肽）的相對分子質量分布的方法。方法：采用TSK-GEL G2000SWXL色譜柱（300 mm×7.8 mm，5 μm）、流動相為 乙腈-水-三氟乙酸（15∶85∶0.07，V/V）、流速0.6 mL/min、柱溫30 ℃、進樣體積10 μL、檢測波長220 nm。結果：在相對分子質量189.1～12 355之間，相對分子質量對數與保留時間 呈線性關系，相關系數為0.995 6，方法精密度、重復性、穩定性良好，準確度高。結論：本方法操作簡便快速、靈敏度高、重復性好，適用于多肽類物質相對分子質量分布的檢測。

凝膠過濾色譜法；大豆；白蛋白；羊胎盤；多肽；相對分子質量

多肽是相對分子質量介于氨基酸與蛋白質之間的一類物質，其吸收機制與游離氨基酸相比，具有耗能低、轉運速度快、載體不易飽和等優點，是當今保健食品領域和生物醫藥領域的研究熱點之一[1]。傳統觀點認為蛋白質在體內需經蛋白酶、腸內菌群等作用完全消化為氨基酸才可以被吸收。隨著蛋白質多肽類物質消化吸收代謝的深入研究，科學家們發現由蛋白質水解得到的小肽（一般認為是二肽、三肽）可被機體完整轉運，此后有研究[2-3]表明4個以上氨基酸殘基組成的寡肽也能被機體直接吸收。吳冬梅等[4]對多種多肽在大鼠離體小腸中的吸收情況進行了研究，認為被吸收肽的相對分子質量多在1 000以內。多肽除了具有良好的吸收特性外，還具 有眾多的生理活性，如抗菌、抗氧化、抗疲勞、調節免疫、血管緊張素轉換酶抑制作用[5-9]。多肽的相對分子質量與其生理活性密切相關[10]，是多肽類產品質量控制的關鍵因素之一，這就需要建立一種能有效測定多肽相對分子質量的方法。

測定相對分子質量的方法有多種，如超濾法[11]、凝膠電泳法[12]、凝膠過濾色譜法[13-14]、質譜法[15-16]等。其中超濾法只能較為粗略地測定相對分子質量分布，在分離純化部分應用較多；凝膠電泳法存在操作繁瑣、重現性差的缺點[17]，且對小肽的相對分子質量測定有很大的局限性，適用于蛋白質、多肽相對分子質量分布研究的初期階段；質譜法能較為精確地測定分子質量分布，但設備昂貴，不宜做常規分析手段[18]；凝膠過濾色譜法具有操作簡便快速、重復性好、精確度高的特點[19-20]，已廣泛應用于測定多肽、多糖等大分子物質的相對分子質量及其分布[21-23]。本實驗采用凝膠過濾色譜法來測定大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盤多肽的相對分子質量，旨在為同類產品的生產制備和質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

相對分子質量標準物質：細胞色素C（Mr12355）、胰蛋白酶抑制劑（Mr6511）、人血管緊張素Ⅱ（Mr1045.5）、乙氨酰乙氨酰酪氨酰精氨酸（Mr451.2）、乙氨酰乙氨酰乙氨酸（Mr189.1） 中國計量科學研究院；大豆肽（編號：SS12204）、白蛋白多肽（編號：SS12265） 武漢天天好生物制品有限公司；羊胎盤多肽 實驗室自制；乙腈（色譜純） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20AD高效液相色譜儀（配有SPD-10A紫外檢測器、CTO-10A柱溫箱） 日本島津公司；TSK-GEL G2000SWXL色譜柱（300 mm×7.8 mm，5 μm） 東曹（上海）生物科技有限公司；AL204型電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；Milli-Q超純水系統儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 相對分子質量標準物質溶液的配制

分別精密稱取相對分子質量標準物質細胞色素C、胰蛋白酶抑制劑、人血管緊張素Ⅱ、乙氨酰乙氨酰酪氨酰精氨酸、乙氨酰乙氨酰乙氨酸適量，加超純水溶解配成2.5 mg/mL的溶液。按1∶1（V/V）的比例將上述溶液混合后搖勻，制成0.5 mg/mL的標準物質溶液，用0.45 μm的濾膜過濾備用。

1.3.2 供試品溶液的配制

分別精密稱取各樣品適量，加超純水溶解配成5.0 mg/mL的溶液，用0.45 μm的濾膜過濾備用。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：TSK-GEL G2000SWXL（300 mm× 7.8 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水-三氟乙酸（15∶85∶0.07，V/V）；流速0.6 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL；檢測波長220 nm。

1.4 統計分析

采用SHIMADZU GPC數據處理軟件分析色譜圖。

1.5 數均相對分子質量和重均相對分子質量的計算[20]

式（1）中：Ni為第i種分子的物質的量；Mi為第i種分子的分子質量。

式（2）中：Wi為第i種分子的質量；Mi為第i種分子的分子質量。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的考察

圖1 凝膠色譜柱對混合標準物質的分離Fig.1 Selection of column for GFC analysis

考察TSK-GEL G2000SWXL凝膠柱（普通批次）和TSK-GEL G2000SWXL凝膠柱（特殊批次）對混合標準物質分離度的影響，結果顯示：采用TSKGEL G2000SWXL凝膠柱（普通批次）時混合標準物質不能實現有效分離，如圖1中1號色譜圖所示，而采用TSKGEL G2000SWXL凝膠柱（特殊批次）時混合標準物質得到有效分離，如圖1中2號色譜圖所示，其中最小分離度2.75，最小理論塔板數10248.8，最大理論塔板數32146.3。故最后選擇TSKGEL G2000SWXL凝膠柱（特殊批次）測定大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盤多肽相對分子質量及其分布。

2.2 流動相的考察

圖2 流動相的考察Fig.2 Optimization of the mobile phase

在流動相中乙腈-水為15∶85（V/V）的前提下，通過調節流動相中三氟乙酸的體積分數（0.01%～0.08%），考察三氟乙酸對混合標準物質分離度的影響，結果顯示（圖2）混合標準物質分離度隨三氟乙酸的體積分數增大而增大，但考慮到該色譜柱的pH值適用范圍為2.5～7.5，三氟乙酸體積分數過大會對色譜柱造成損傷，最后將三氟乙酸的的體積分數定為0.07%。

2.3 標準曲線的繪制

取混合標準物質溶液，進樣10μL，記錄色譜圖，如圖3所示。

圖3 混合標準物質凝膠過濾色譜圖Fig.3 GFC chromatogram of mixed standards

5種標準物質的保留時間、相對分子質量和相對分子質量對數的關系見表1。

表1 5種標準物質的保留時間和相對分子質量的對應關系Table 1 Relationships of retention time with relative molecular weights of five standards

以標準物質相對分子質量對數lgM對保留時間t做線性回歸，得回歸方程為lgM=―0.286t+6.939，相關系數r=0.9956，說明在相對分子質量189.1～12355范圍內，5種標準物質相對分子質量對數與保留時間呈良好的線性關系。

2.4 精密度實驗

取羊胎盤多肽供試品溶液10 μL，按1.3.3節色譜條件連續進樣6 次，測定保留時間為14.8 min左右的主色譜峰的保留時間和峰面積，計算其相對標準偏差分別為0.040%、0.037%，表明方法的精密度良好。

2.5 重復性實驗

精密稱取羊胎盤多肽供試品6 份，每份25 mg，按1.3.2節制備供試品溶液，按1.3.3節色譜條件分別進樣，測定保留時間為14.8 min左右的主色譜峰的保留時間和峰面積，計算其相對標準偏差分別為0.033%、0.273%，表明方法的重復性良好。

2.6 穩定性實驗

取羊胎盤多肽供試品溶液10 μL，按1.3.3節色譜條件分別于取樣后0、2、4、6、8、18、24 h進樣，測定保留時間為14.8 min左右的主色譜峰的保留時間和峰面積，計算其相對標準偏差分別為0.147%、0.255%，表明方法的穩定性良好。

2.7 準確度實驗

精密稱取相對分子質量標準物質人血管緊張素Ⅱ6份，加超純水溶解配成0.5 mg/mL的溶液。按1.3.3節色譜條件分別進樣分析，通過凝膠過濾色譜法得到的相對分子質量與標準物質已知相對分子質量相對照，基本吻合（表2）。

表2 準確度實驗結果Table 2 Results of accuracy tests

2.8 樣品測定

圖4 大豆肽（A）、白蛋白多肽（B）、羊胎盤多肽（C）凝膠過濾色譜圖Fig.4 GFC chromatograms of soy peptide (A), albumin polypeptide (B), and sheep placenta polypeptide (C)

按1.3.3節色譜條件分別對大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盤多肽進樣測定，記錄色譜圖，如圖4所示。采用SHIMADZU GPC數據處理軟件分別對以上色譜圖進行處理。各樣品中一些主要色譜峰的保留時間、重均相對分子質量（Mw）、數均相對分子質量（Mn）、多分散系數d（Mw/Mn）的基本情況如表3所示。

表3 大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盤多肽相對分子質量及其分布的測定結果Table 3 Rel ative molecular weights and distribution of soy peptide, albumin polypeptide and sheep placenta polypeptide

從表3可知，大豆肽、羊胎盤多肽、白蛋白多肽的重均相對分子質量都在1 000以下，其中大豆肽的重均相對分子質量主要集中在169～935之間、羊胎盤多肽的重均相對分子質量主要集中在180～986之間，而白蛋白多肽的重均相對分子質量相對較小。

3 討 論

根據凝膠過濾原理，同一類型化合物的保留時間與組分的相對分子質量有關，大分子保留時間短，小分子保留時間長，根據標準物質的保留時間與相對分子質量的線性關系便可推算出未知組分的相對分子質量。利用此法測定肽類物質的相對分子質量及其分布具有較高的精密度，而且操作簡單、結果可靠，適用于各種來源多肽的相對分子質量及其分布的測定。

蛋白質、多肽類產品的分子質量具有多分散性，所以其分子質量只具有統計平均的意義。用實驗方法測定的相對分子質量只是統計平均值，若要確切描述多肽的相對分子質量，除了知道統計平均值外，還應明確多肽的相對分子質量分布。數均相對分子質量（Mn）是根據樣品中不同相對分子質量分子的數目統計的平均相對分子質量；重均相對分子質量（Mw）是根據樣品中不同相對分子質量分子的質量統計的平均相對分子質量；多分散系數d為重均相對分子質量與數均相對分子質量的比值，用以表征樣品分子質量的分散程度。d值越大，說明分子質量越分散，d值為1時，說明分子質量呈單分散[20]。在采用酶法水解蛋白質制備多肽的過程中，水解過度會產生苦味肽和大量氨基酸，水解不全將得不到理想的多肽。有報道[24]稱雞肉在酶解過程中，其呈味成分會隨著水解程度的改變而改變。此外，水解度與酶解產物的乳化性、起泡性、溶解性、穩定性等也具有一定的關系[25-26]。因此，在水解過程中必須嚴格控制蛋白質的水解度。多肽的相對分子質量分布與蛋白質水解度密切相關，可直接客觀地反映出水解程度。采用凝膠過濾色譜法測定多肽的相對分子質量分布，對多肽的生產制備和質量控制都具有重要的指導意義。

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Determination of Relat ive Molecular Weight Distribution of Polypeptides from Three Different Sources by Gel Filtration Chromatography

JIANG Teng-chuan1, SONG Xin-bo1,2,*, ZHANG Li-juan1
(1. Graduate School, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 2. Tianjin Zhongyi Pharmace u tical Co. Ltd., Tianjin 300193, China)

Objective: To establish a method to determine the relative molecular weight distribution of soy peptide, albumin polypeptide and sheep placenta polypeptide using gel fi ltration chromatography (GFC). Methods: TSK-GEL G2000SWXL (300 mm × 7.8 mm, 5 μm) column was equilibrated with a mobile phase composed of acetonitrile-water-trifl uoroacetic acid (15:85:0.07, V/V) at a fl ow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was 30 ℃ and the injection volume was 10 μL. The detection wavelength was 220 nm. Results: A linear relationship between the logarithm of relative molecular weight and retention time was achieved in the relative molecular weight range of 189.1–12 355 with a correlation coeffi cient of 0.995 6. The precision, repeatability, stability and accuracy of the GFC method were good. Conclusion: This method is simple, rapid, sensitive, and reproducible for the determination of the relative molecular weight distribution of polypeptides.

gel fi ltration chromatography; soybean; albumin; sheep placenta; polypeptides; relative molecular weight

O657.7

A

1002-6630（2014）24-0312-04

10.7506/spkx1002-6630-201424060

2012-11-20

蔣騰川（1989—），女，碩士研究生，主要從事中藥研究與開發。E-mail：jiangtengchuan@163.com

*通信作者：宋新波（1964—），男，研究員，學士，主要從事中藥研究與開發。E-mail：songxinbo@tjutcm.edu.cn