響應面法優化紅螞蟻抗菌物質提取工藝

陳海燕，馮 印，楊 柳，尤麗新，陳曉平*

（1.長春科技學院生物食品學院，吉林 長春 130600；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

響應面法優化紅螞蟻抗菌物質提取工藝

陳海燕1，馮 印1，楊 柳1，尤麗新1，陳曉平2,*

（1.長春科技學院生物食品學院，吉林 長春 130600；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

以長白山野生紅螞蟻為原料，提取紅螞蟻體內有效抗菌活性物質并進行抑菌效果評價。通過單因素試驗和響應面分析法研究乙醇體積分數、料液比、離心轉速對紅螞蟻提取物抑制大腸桿菌的影響，結果表明：最佳浸提條件為乙醇體積分數63%、料液比1∶26（g/mL）、離心轉速7 230 r/min，對大腸桿菌抑菌圈直徑為2.59 cm。

響應面法；紅螞蟻；抗菌物質

螞蟻具有較高的藥用價值，具有明顯的抗炎、護肝、平喘、鎮痛功效，并具有一定的抗癌作用。此外，螞蟻體內還含有一類特殊的物質，因其對細菌、真菌等的生長具有明顯的抑制作用，被稱為“螞蟻抗生素”[1-4]。

螞蟻體內含有大量的蛋白質、氨基酸、維生素及微量元素[5]等，研究發現，螞蟻可分泌具有抗菌活性物質，以此抵御環境微生物侵襲[6-7]。目前已報道螞蟻中抗菌物質主要有多糖或聚合糖類、抗菌肽、激素及代謝后的小分子物質并具有潛在的藥用價值。長白山紅螞蟻自身活性物質不僅具有鎮靜、止咳、平喘、消炎等效果，對真菌及金黃色葡萄球菌具有抑制作用，因此長白山紅螞蟻具有“天然抗生素”之稱[8-10]。

本研究以長白山野生紅螞蟻為原料，采用乙醇浸提法對紅螞蟻體內抗菌物質進行粗提取。以抑菌圈直徑為衡量指標，通過單因素試驗和響應面分析法研究乙醇體積分數、料液比、離心轉速對紅螞蟻抑菌物質提取效果的影響，以其獲得最佳提取工藝參數，為紅螞蟻開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山野生紅螞蟻由吉林農業大學食品工程教研室提供。大腸桿菌（Escherichia coli）為長春科技學院生物化學實驗室保藏菌種。

LB液體培養基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，1 mol/L NaOH溶液調pH 7.2，補雙蒸水至1 L。

乙醇 北京化工廠；蛋白胨（BR）、酵母浸粉（BR） 北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂粉（BR） 天津市致遠化學試劑有限公司；氯化鈉（AR） 天津市科密歐化學試劑有限責任公司。

1.2 儀器與設備

HD-1360超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培養箱 上海江萊生物科技有限公司；RE-52A旋轉蒸發器 上海嘉鵬科技有限公司；SHZ-D型循環水真空泵 鄭州科達機械儀器設備有限公司；LG10-2.4A型高速離心機 北京醫用離心機廠；FA1004A電子天平 常州科源電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預處理

取紅螞蟻100 g，用蒸餾水漂洗干凈，放在托盤內攤平。將托盤放入烘箱，在40 ℃條件下烘干12 h以上，直至其質量恒定，然后用組織粉碎機進行粉碎，過60 目篩得紅螞蟻粉，備用。

1.3.2 乙醇法提取紅螞蟻抗菌物質的單因素試驗

分別以乙醇體積分數、料液比和離心轉速作為變量因素，其他影響因素條件不變，對紅螞蟻抗菌物質進行粗提取，分析不同變量因素對提取率的影響，以確定各因素水平的最佳值。

1.3.2.1 乙醇體積分數對紅螞蟻抗菌物質提取效果的影響

準確稱取25 g紅螞蟻粉，平均分為5份，按料液比1∶20（g/mL）分別加入體積分數為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液各100 mL，用電動勻漿機進行勻漿，置于4 ℃冰箱浸提24 h。然后分別放入高速冷凍離心機中，離心20 min（4 ℃，8 000 r/min）。取上清液，用旋轉蒸發儀在40 ℃條件下揮去溶劑乙醇，然后置于冷凍干燥機中進行冷凍干燥，所得物質即為紅螞蟻乙醇提取物。分別溶于10 mL無菌蒸餾水，以大腸桿菌為受抑菌做抑菌實驗[8]，觀察不同乙醇體積分數條件下提取的紅螞蟻抗菌物質抑菌圈直徑大小。

1.3.2.2 料液比對紅螞蟻抗菌物質提取效果的影響

準確稱取25 g紅螞蟻粉，平均分為5份，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入60%乙醇溶液，用電動勻漿機進行勻漿，置于4 ℃冰箱浸提24 h。然后分別放入高速冷凍離心機中，離心20 min（4 ℃，8 000 r/min）。方法同1.3.2.1節。試驗重復3 次，求平均值。

1.3.2.3 離心轉速對紅螞蟻抗菌物質提取效果的影響

準確稱取25 g紅螞蟻粉，平均分為5份，在料液比1∶20（g/mL）條件下加入體積分數為60%的乙醇溶液各100 mL，置于電動勻漿機中進行勻漿，在4 ℃冰箱浸提24 h。放入高速冷凍離心機，在4 ℃條件下分別以轉速6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 r/min離心20 min。方法同1.3.2.1節。試驗重復3 次，求平均值。

1.3.3 瓊脂孔穴擴散法測定抑菌效果

采用瓊脂空穴擴散法[11-12]，首先將菌種進行活化處理，將大腸桿菌接種至LB液體培養基，振蕩使菌種均勻散布于培養基中，將其置于37 ℃培養箱內培養48 h，活化2～3 次。將加熱融化的LB固體培養基15 mL注入到平皿中，待凝固后，吸取103CFU/mL的受試菌液100?L加入平皿，涂布均勻，在培養基上打直徑為6 mm的圓孔。用移液槍吸取40 ?L抗菌物質粗提液加入孔洞，并做陰性、陽性對照。陰性對照組加入40 ?L無菌蒸餾水，陽性對照組加入40 ?L 100 ?g/mL的氨芐青霉素溶液。將培養基平皿在37 ℃環境下培養24 h。觀察紅螞蟻抗菌物質粗提液對大腸桿菌有無抑菌效果，并測量抑菌圈直徑。

1.3.4 響應面法優化紅螞蟻抗菌物質提取條件

通過單因素試驗得到每個因素水平的3 個最優數據，以Design-Expert軟件要求的Box-Behnken試驗設計三因素三水平優化試驗[13-16]。采用大腸桿菌為受抑菌，測量不同提取條件下紅螞蟻抗菌物質粗提物的抑菌圈直徑。試驗重復3 次，計算平均值。設計方案見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

2 結果與分析

2.1 乙醇體積分數對紅螞蟻抗菌物質提取的影響

圖1 乙醇體積分數對紅螞蟻抗菌物質提取的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由圖1可知，在料液比1∶20、離心轉速8 000 r/min的條件下，隨著乙醇體積分數的增大，所提取紅螞蟻抗菌物質抑菌圈直徑先增大后減小。當以60%乙醇進行提取時，所提取抗菌物質抑菌圈直徑為2.04 cm，提取效果最佳。已有研究[17-18]發現紅螞蟻中所含抗菌物質主要為肽類，其他研究[19-21,23]中利用此方法提取時，提取物的菌圈直徑略小。2.2 料液比對紅螞蟻抗菌物質提取的影響

圖2 料液比對紅螞蟻抗菌物質提取的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由圖2可知，在乙醇體積分數60%、離心轉速8 000 r/min的條件下，隨著溶劑用量增大，抑菌圈直徑表現為逐漸增大并趨于平穩的趨勢。當料液比為1∶25時，抑菌圈直徑達到最大值，為2.48cm。徐立等[22]研究的提取液經干燥成粉狀，主要針對抗炎鎮痛等臨床效果，忽略了抗菌效果研究。

2.3 離心轉速對紅螞蟻抗菌物質提取的影響

圖3 離心轉速對紅螞蟻抗菌物質提取的影響Fig.3 Effect of centrifugal speed on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由圖3可知，在乙醇體積分數60%、料液比1∶20的條件下，隨著離心轉速的增大，抑菌圈直徑表現為先增大后減小的趨勢。當離心轉速為7 000 r/min時，抑菌圈直徑達到最大值，為2.18 cm。

2.4 瓊脂孔穴擴散法測定抑菌效果

圖4 紅螞蟻抑菌成分對大腸桿菌的抑菌效果Fig.4 Antibacterial effect of red ant extracts

長白山野生紅螞蟻抑菌物質對大腸桿菌的抑菌效果如圖4所示，1號孔陽性對照即100 ?g/mL氨芐青霉素溶液對大腸桿菌的抑菌圈直徑為2.48 cm，抑菌效果很好，2號孔陰性對照即蒸餾水對大腸桿菌無抑菌效果，3、4號孔紅螞蟻抑菌成分提取液對大腸桿菌的抑菌圈平均直徑為2.59 cm。通過陰性及陽性對照，可知紅螞蟻抑菌成分提取液對大腸桿菌的抑菌效果很好，其有效抗菌成分可與中成藥復配治療男性性功能疾病[24-26]。

2.5 響應面試驗優化

2.5.1 響應面試驗結果

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由表2可知，不同提取條件下得到的紅螞蟻抗菌物質粗提物的抑菌圈直徑范圍為1.67～2.55 cm，顯然抗菌物質的提取受不同條件影響較大[24]。故采用響應面法對紅螞蟻抗菌物質的提取條件進行優化是可行的。

2.5.2 模型的建立與方差分析

對響應面法優化試驗結果建立二次模型及進行方差分析，結果見表3。

表3 響應面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the response surface quadratic model

由表3可知，該二次方程模型P＜0.000 1，達到極顯著影響水平。乙醇體積分數一次項（A）、料液比一次項（B）、離心轉速一次項（C）以及乙醇體積分數二次項（A2）、料液比二次項（B2）、離心轉速二次項（C2）P值均小于0.000 1，對抑菌圈直徑的大小有極顯著影響，乙醇體積分數和料液比的交互項（AB）、料液比和離心轉速的交互項（BC）P值在0.0001～0.05，達到顯著影響水平。而乙醇體積分數和離心轉速的交互項（AC）則對抑菌圈直徑大小的影響不顯著。

模型F值為881.14，P＜0.000 1，說明該二次多項模型顯著性良好；失擬分析表明，失擬項的P值為0.062 5，設計模型的失擬度不顯著，因而該模型的擬合程度比較好。響應面二次方程模型的相關系數為擬合度R2=0.999 1，說明模型與數據擬合度較好；校正擬合度=0.998 0，預測擬合度=0.985 9。其中=0.985 9與=0.998 0在一致性上是合理的。

根據Box-Behnken試驗設計原理，利用Design-Expert軟件，得到關于抑菌圈直徑的二次多項回歸方程為：Y=2.55+0.17A+0.18B+0.11C+0.055AB-0.012AC-0.045BC-0.29A2-0.29B2-0.21C2。

2.5.3 各因素對紅螞蟻抗菌物質提取的影響

圖5 乙醇體積分數與料液比對提取紅螞蟻抗菌物質影響的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effect of the effect of ethanol concentration and material-to-liquid ratio on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由圖5可知，在離心轉速7 000 r/min的條件下，響應面圖中影響因素乙醇體積分數和料液比的曲面均較陡，說明乙醇體積分數和料液比對所提取的紅螞蟻抗菌物質的抑菌圈直徑大小均有極顯著影響，呈二次關系。當乙醇體積分數為55%～60%，接近60%，料液比1∶22.5～1∶25，更加接近1∶25時，抑菌圈直徑為最大值。而隨著乙醇體積分數和溶劑用量的增大，抑菌圈直徑逐漸減小。此外在等高線圖中等高線趨于橢圓形，乙醇體積分數和料液比的交互項對抑菌圈大小具有顯著影響。

圖6 乙醇體積分數與離心轉速對提取紅螞蟻抗菌物質影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effect of ethanol concentration and centrifugal speed on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由圖6可知，在料液比1∶25的條件下，乙醇體積分數和離心轉速的曲面均較陡，說明乙醇體積分數和離心轉速對所提取的紅螞蟻抗菌物質的抑菌圈直徑大小均有極顯著影響，呈二次關系。當乙醇體積分數為55%～60%，接近60%，離心轉速6 500～7 000 r/min，更加接近7 000 r/min時，抑菌圈的直徑達到最大。隨著乙醇體積分數和離心轉速的增加，抑菌圈直徑卻逐漸減小。此外在等高線圖中等高線實際趨于圓形，乙醇體積分數和離心轉速的交互項對抑菌圈大小的影響不顯著。

圖7 料液比與離心轉速對提取紅螞蟻抗菌物質影響的響應面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the effect of material-to-liquid ratio and centrifugal speed on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由圖7可知，在乙醇體積分數60%的條件下，響應面圖中影響因素料液比和離心轉速的曲面均較陡，說明料液比和離心轉速對所提取的紅螞蟻抗菌物質的抑菌圈直徑大小均有極顯著影響，呈二次關系。當料液比為1∶22.5～1∶25，接近1∶25，離心轉速為6 500～7 000 r/min，更接近7 000 r/min時，抑菌圈直徑達到最大值。而隨著溶劑用量和離心轉速的繼續增大，抑菌圈直徑逐漸減小。此外在等高線圖中等高線趨于橢圓形，料液比和離心轉速的交互項對抑菌圈直徑大小具有顯著影響。2.6 乙醇浸提法提取紅螞蟻抗菌物質的最佳工藝條件

通過Design-Expert軟件求解關于抑菌圈直徑的二次多項回歸方程，得到紅螞蟻抗菌物質的最佳提取條件為乙醇體積分數63.15%、料液比1∶26.67（g/mL）、離心轉速7 229.5 r/min，在此條件下的抑菌圈直徑理論值為2.62 cm。鑒于實驗的可行性，采用修正后的提取條件，即乙醇體積分數63%、料液比1∶26（g/mL）、離心轉速7 230 r/min。進行3 次驗證實驗，求平均值，得到抑菌圈直徑為2.59 cm，與理論值的相對誤差為1.16%，說明該二次多項回歸方程與實際情況吻合，采用響應面法優化紅螞蟻抗菌物質的提取條件是可行的。

3 結 論

本實驗主要研究長白山紅螞蟻抗菌活性物質的提取并通過抑菌實驗表明此類抗菌物質對大腸桿菌具有良好的抑制效果。通過單因素試驗和響應面法優化試驗，確定了紅螞蟻抗菌物質的最佳提取條件。并有待于進一步嘗試其對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、枯草芽孢桿菌等在食品加工貯藏中常見的有害菌進行系統抗菌研究。并針對長白山野生紅螞蟻中抗菌活性物質的成分分析進一步細化研究，因此長白山野生紅螞蟻具有良好的應用前景。

通過對響應面優化試驗結果進行分析，采用乙醇浸提法從紅螞蟻中提取抗菌物質的最佳工藝條件為乙醇體積分數63%、料液比1∶26（g/mL）、離心轉速7 230 r/min。優化條件下，長白山紅螞蟻乙醇浸提液對大腸桿菌抑菌圈直徑為2.59 cm。

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Optimization of Extraction of Antibacterial Compounds from Red Ants with Response Surface Methodology

CHEN Hai-yan1, FENG Yin1, YANG Liu1, YOU Li-xin1, CHEN Xiao-ping2,*
(1. College of Biotechnology and Food Science, Changchun University of Science and Technology, Changchun 130600, China; 2. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Antibacterial compounds were extracted from wild red ants from the Changbai Mountains and their antibacterial activity was evaluated. The anti-E. coli activity as a function of ethanol concentration, solid-to-solvent ratio and centrifugal speed was investigated using response surface methodology. The diameter of the inhibition zone against E. coli was 2.59 cm under the optimal extraction conditions: 63% aqueous ethanol, a solid-to-solvent ratio of 1:26 (g/mL) and centrifugation at a speed of 7 230 r/min.

response surface methodology; red ant; antimicrobial compounds

TS201.3

A

1002-6630（2014）22-0073-05

10.7506/spkx1002-6630-201422014

2014-06-11

吉林省重大科技資助項目（20060208）

陳海燕（1980—），女，講師，碩士，研究方向為食品生化與功能性食品。E-mail：haiyan821088@163.com

*通信作者：陳曉平（1963—），男，教授，博士，研究方向為食品生化與功能性食品。E-mail：13578883136@163.com