降解赭曲霉毒素A菌株的篩選及其鑒定

王峻峻，張紅印*，楊其亞

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013）

降解赭曲霉毒素A菌株的篩選及其鑒定

王峻峻，張紅印*，楊其亞

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013）

為了提供篩選生物降解赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）的便利條件，優化水系中OTA的測定方法。通過在水系中添加甲醇或乙醇的方法，使得水系中OTA回收率超過了90%，此外通過對比，當甲醇或乙醇與樣液體積比為1∶1時，足以準確測定水系中OTA含量。利用以上方法對降解OTA的菌株進行篩選，發現細菌B-1和酵母Y-2均能夠降解OTA，且細菌B-1在2 d時能降解87%的OTA，3 d將OTA全部降解，而酵母Y-2在2 d時就能夠降解84%的OTA，在后續的培養中維持降解率不變。此外，利用液質聯用法進一步確定了菌株B-1和Y-2的降解作用，并分析了降解產物。最后，通過分別分析細菌B-1和酵母Y-2的16S rDNA和ITS rDNA序列，菌株B-1鑒定為泡囊短波單胞菌，菌株Y-2鑒定為耶羅維亞酵母。

赭曲霉毒素A；回收率；降解；微生物；篩選；鑒定

利用微生物，尤其真菌，降解赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）的研究，取得了良好的效果。Abrunhosa等[1]將Phaffia rhodozyma CBS 5905與OTA在20 ℃條件下培養15 d后，利用二氯甲烷提取發酵液中OTA，發現OTA降解了90%；Varga等[2]將黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉（Rhizopus）以及釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培養在含有OTA的發酵液中，一段時間后，先將發酵液酸化，再利用氯仿萃取，然后通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）等方法來測定OTA含量。從文獻報道可以看出，測定水系溶液中的OTA，大多采用了萃取的方法。這是因為OTA易溶于極性有機物，而微溶于水[3-4]。但OTA標準品價格昂貴，加之萃取方法需試劑較多，同時耗時長、易造成較大誤差，尤其不適合處理大量樣品，因此亟需一種簡便快速的方法來處理水系OTA樣品。本實驗首先優化水系OTA樣品的前處理方法，將篩得的菌株分別與OTA一起培養一段時間后，利用建立的樣品前處理方法，初步確定能夠降解OTA的實驗菌株。由于高效液相-質譜聯用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）可以排除其他未知因素引起的OTA含量的變化，但是檢測成本較高，因此為節省成本，本實驗僅對能夠降解OTA的菌株進行HPLC-MS實驗，進一步驗證篩選出的菌株對OTA的降解作用，并利用分子生物學方法對它們進行鑒定[5-9]。篩選出的兩株降解OTA菌株，目前還未見關于它們降解OTA的報道，這對以后生物降解OTA的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養基

乙腈、甲醇（均為色譜級） Teida公司；OTA標準品（純度大于99%） Pribo Lab公司；其他試劑為分析純。

PM培養基：酵母浸膏5 g、蔗糖10 g、蛋白胨5 g、麥芽糖2 g，蒸餾水1 000 mL；NA培養基：氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、牛肉粉3 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL；PA培養基：酵母浸膏5 g、蔗糖10 g、蛋白胨5 g、麥芽糖2 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL；NB培養基：氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、牛肉粉3 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 儀器與設備

安捷倫1100高效液相檢測儀（配有熒光檢測器）美國安捷倫公司；LXQ液相色譜-質譜聯用儀 美國Thermo公司。

1.3 OTA標準曲線的制作

1.3.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；柱溫30 ℃；流動相為乙腈-1%乙酸（60∶40，V/V）；流速1.0 mL/min；進樣量20 ?L；激發波長（Ex）為333 nm，發射波長（Em）460 nm。

1.3.2 具體操作

將1 mg OTA溶解于10 mL的甲醇中，制成100 μg/mL的OTA儲備溶液，保存于-20 ℃。利用該儲備液，以甲醇為溶劑分別配制2 000、1 000、100、50、25、5 ng/mL的OTA標準溶液Ⅰ，在已確定的1.3.1節所述的色譜條件下，測定不同質量濃度OTA標準溶液Ⅰ的色譜峰面積，多次測量取平均值。根據色譜峰面積與OTA質量濃度關系作出OTA的標準曲線。

1.4 水系OTA樣品前處理方法的建立

1.4.1 OTA標準溶液Ⅱ的制備

利用OTA儲備液，以PM液體培養基為溶劑，分別制備2 000、1 000、100、50 ng/mL的OTA標準溶液Ⅱ。1.4.2 最優溶劑及體積的確定

以質量濃度為1 μg/mL的OTA標準溶液Ⅱ為實驗對象，分析添加不同量的甲醇對測定結果的影響：取1 μg/mL的標準溶液Ⅱ200 μL，分別按照標準溶液Ⅱ與甲醇體積比為1∶1、1∶2、1∶3的比例加入200、400、600 μ L甲醇，旋渦振蕩30 s混勻后，用0.22 μm的濾膜過濾后，利用高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-fluorescence detector，HPLC-FLD）測定，計算OTA的回收率。

以同樣的方法，按照標準溶液Ⅱ與乙醇體積比為1∶1、1∶2、1∶3的比例加入200、400、600 μL乙醇，旋渦振蕩、過濾后，測定并計算OTA的回收率。

1.4.3 OTA回收率的計算

式中：ρ為實際測得的OTA質量濃度/（μg/mL）；ρ0為OTA的理論質量濃度/（μg/mL）。

1.4.4 進一步驗證方法的可行性

通過以上實驗結果，選擇回收率最高的溶劑添加量處理質量濃度分別為2 000、1 000、100、50 ng/mL OTA標準溶液Ⅱ，測定其OTA質量濃度，并計算回收率，同時對比不添加任何溶劑，直接用0.22 μm濾膜過濾的標準品的回收率。

1.5 降解OTA菌株的初步篩選

1.5.1 菌種的分離

在葡萄園中收集土樣、枝葉以及果實后，將其包裝在無菌袋中，盡量在當天運回實驗室。采用梯度稀釋法、平板涂布法分離單菌落。

1.5.2 菌種活化

將分離到的細菌培養在NA斜面上約24 h，酵母培養在PA斜面上約48 h；培養后的菌株置于4 ℃冰箱保存。

1.5.3 菌懸液濃度的調節

用接種環挑取適量菌體到無菌生理鹽水中，調節菌體濃度為1×107CFU/mL；酵母菌用血球計數板計數，細菌用分光光度計計數，在波長600 nm處測定OD值為2.0時，菌液濃度約為1×108CFU/mL。

1.5.4 降解OTA菌株的篩選

向50 mL液體培養基（酵母菌用PM培養基，細菌用NB培養基）中加入適量OTA儲備溶液，以調節OTA的初始質量濃度約為1 μg/mL；然后加入1 mL菌濃度為1×108CFU/mL待測菌液，分別在37 ℃和28 ℃的條件下，搖床培養分離到的細菌和酵母；同時，以不加微生物僅加入OTA的液體培養基作為陰性對照。每天定時取樣，取樣一周，利用1.4節建立的方法處理樣品，測定OTA質量濃度。

1.5.5 OTA降解率的計算

式中：ρ為初始OTA質量濃度/（μg/mL）；ρ0為1 周后樣品中OTA質量濃度/（μg/mL）。1.6 液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）驗證菌株降解OTA的作用

1.6.1 質譜條件

ESI檢測器參數：噴霧電壓4 500 V；毛細管電壓30 V；毛細管溫度325 ℃；正離子模式下，掃描質荷比m/z范圍為100～600；母離子m/z 404。

1.6.2 樣品預處理

按1.4節方法制備OTA的初始質量濃度為2 μg/mL的OTA標準溶液Ⅱ，然后加入1 mL菌濃度為1×107CFU/mL待測菌液，分別在37 ℃和28 ℃條件下，搖床培養分離到的細菌和酵母；對照僅加入OTA不加任何微生物。培養3 d后，取樣300 μL，并加入300 μL乙醇，漩渦振蕩30 s混勻，用0.22 μm的濾膜過濾后進行LC-MS測定。

1.7 降解OTA菌株的鑒定

1.7.1 DNA的提取

用接種環挑半環菌于100 μL無菌雙蒸水中，混勻，于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀100 ℃加熱15 min，以破裂細胞壁，最后再加200 μL無菌雙蒸水，即得模板DNA，將其保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.7.2 序列分析

細菌采用的16S rDNA序列分析法，使用引物為27F（5’-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’）；酵母菌采用的5.8S rDNA-ITS序列分析法，使用引物為ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離結果

在葡萄園中主要分離到6 株菌，分別標記為Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5和B-1，其中B-1為細菌，其他均為酵母菌。

2.2 OTA的標準曲線

采用HPLC-FLD測定不同質量濃度（5、25、50、100、1 000、2 000 ng/mL）OTA的標準曲線，由該曲線得到峰面積與OTA 質量濃度之間的關系為：y=2.645x+ 1.400 3，線性相關系數R2為0.999 5，即OTA質量濃度與HPLC檢測峰面積呈高度線性關系。

2.3 水系OTA樣品前處理方法的建立

2.3.1 溶劑種類及添加量對OTA標準溶液Ⅱ回收率的影響

表1 添加不同體積的甲醇對OTA回收率的影響Table1 OTA recovery by adding different volumes of methanol

表2 添加不同體積的乙醇對OTA回收率的影響Table2 OTA recovery by adding different volumes of ethanol

由于OTA易溶于極性有機溶劑，因此首先考察了添加不同體積的甲醇和乙醇對OTA標準溶液回收率的影響。表1和表2分別對比了在水系溶液中，添加不同體積的甲醇和乙醇對OTA回收率的影響。由表可以看出，加入不同體積的甲醇或乙醇，OTA回收率均在95%左右，且互相之間沒有顯著性差異。因此選擇1∶1的溶劑添加量（200 μL）處理樣品，既可以獲得較高的回收率，又節約了溶劑。

2.3.2 添加溶劑對不同質量濃度的OTA標準溶液回收率的影響

圖1 不同方法處理樣液后OTA回收率Fig.1 Recovery rates of OTA determined by different alcohols or nothing

由圖1可知，當甲醇或乙醇以1∶1的添加量處理不同質量濃度的標準品溶液Ⅱ時，均能得到較高的OT A回收率（＞94%），且互相之間沒有顯著性差異，這表明此方法對低質量濃度和高質量濃度的水系中OTA測定都適用；但是當不添加任何溶劑、直接取樣液過濾后進行測定，得到的OTA回收率結果普遍偏低，且數據穩定性不好、相對偏差較大?？紤]到乙醇相對于甲醇的毒性小，最后選取乙醇用于后面實驗中OTA的測定。

2.4 降解OTA菌株的篩選

2.4.1 HPLC法對降解OTA菌株的初篩

圖2 OTA在不含微生物的培養基中的自然降解情況Fig.2 OTA degradation in medium not inoculated with microorganisms

由圖2可知，在28 ℃搖床條件下培養一周，不加微生物的PM培養基和NB培養基中，OTA的降解率幾乎均為零，這也表明了OTA在自然條件下穩定性極強、很難降解的特性。OTA質量濃度略有波動，可能是由于測定時，因環境因素（如溫度、光照）的略微變化對熒光強度造成影響而引起的；而后期OTA的質量濃度略有增大，可能是由于水分的蒸發造成的。

圖3 實驗菌株對OTA的降解效果Fig.3 OTA degradation by isolated strains

所分離的各菌株對OTA的降解效果見圖3，可以看出菌株Y-2（圖3B）在培養1 d后就能夠降解23% OTA，在第2天降解率達到最大，為83%；與之對比，菌株B-1（圖3F）具有更強的降解OTA的能力，培養2 d后OTA的降解率達到了90%，到第3天，在實驗條件下已經檢測不到OTA。

2.4.2 利用LC-MS進一步驗證降解菌株對OTA的降解作用

圖4 OTA的LC-MS總離子流圖Fig.4 LC-MS total ion chromatograms of OTA before and after microbial degradation

由圖4可知，通過總離子流圖譜（t o t a l i o n chromatogram，TIC）可以看出對照在5.9 min左右有一個明顯的峰（圖4A），而加入菌株Y-2（圖4B）和B-1（圖4C）的溶液中在該處基本都沒有峰，此外沒有發現新物質的產生。因此這一結果進一步驗證了菌株B-1和Y-2具有降解OTA的作用。

圖5 菌株B-1的進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of B-1

圖6 菌株Y-2的進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of Y-2

2.5 降解OTA菌株的鑒定

由圖5、6可知，菌株B-1和菌株Y-2分別與Brevundimonas vermicularis strain KNUC9003、Yarrowia lipolytica strain GX4-1A有親緣關系；即菌株B-1為泡囊短波單胞菌（Brevundimonas vermicularis），而菌株Y-2為耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）。

3 討 論

甲醇或乙醇是極性較大的有機溶劑，與水互溶。OTA易溶于甲醇或乙醇但不溶于水。因此當往OTA水溶液中加甲醇或乙醇，能夠使得兩者成為互溶的體系，OTA溶于此體系，利用此原理省卻了萃取的繁瑣步驟。實驗結果表明，在水系溶液中測定OTA含量的時候，直接過濾進行HPLC測定引入的誤差大、且實驗數據穩定性差。而無論添加甲醇還是乙醇對樣品進行前處理，都能夠得到較高的OTA回收率（＞94%），準確地反映OTA的質量濃度。當甲醇或乙醇分別以1∶1、2∶1、3∶1的添加比例處理樣品時，OTA的回收率沒有顯著性差異。也即隨著甲醇或乙醇加入量的增加，OTA的回收率并沒有增加。因此當甲醇或乙醇以1∶1的添加比例處理樣品時即可滿足測定的要求。根據這一現象也可推斷OTA回收率沒有達到100%可能是人為或系統誤差造成的。

降解實驗結果表明，分離到的菌株B-1和Y-2對OTA均具有很好的降解效果，且通過總離子圖可以看出，此試驗條件下并沒有檢測到生物降解OTA可能產生的代謝物，關于這一點還需在更深層次上進行進一步分析。

分別對B-1、Y-2這兩株菌的rDNA-ITS、16S rDNA序列擴增、測序以及構建系統發育樹，確定菌株B-1為泡囊短波單胞菌（Brevundimo nas vermicularis），菌株Y-2為耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）。泡囊短波單胞菌是一種罕見的條件致病菌，主要存在于土壤中，目前關于它的報道都是一些致病方面的，它能夠引起關節炎、腦膜炎、肝膿腫以及血液疾病等[10-11]。此外，雖然泡囊短波單胞菌引起的發病率以及死亡率，目前尚不清楚，但是實驗過程中使用這種菌的時候仍需要慎重。耶羅維亞酵母是在1942年首次分離得到的，它曾先后被命名為Candida lipolytica、Endomycopsis lipolytica、Saccharomycopsis lipolytica，最終定名為Yarrowia lipolytica[12]。耶羅維亞酵母能夠利用甘油、乙酸、脂肪酸以及多種烴類等物質作為碳源，這一生長的特性，賦予了它對較惡劣的環境的抵御能力，使得它在有機廢棄物治理、污水處理方面得到廣泛的研究，這在國內外文獻中均見有關研究報道[8,13-16]；此外，在非模式酵母菌株中，耶羅維亞酵母的表達系統被看作是最具有開發潛力的，因此經常被用于外源蛋白的表達[9-18]；但目前關于耶羅維亞酵母降解毒素的研究尚未見報道。

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Screening and Identification of Microorganisms for Ochratoxin A Degradation

WANG Jun-jun, ZHANG Hong-yin*, YANG Qi-ya
(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

An optimized method for determining of ochratoxin A (OTA) in aqueous solution was proposed, and screening of si x strains isolated from vineyard soil for microbial OTA degradation was performed using the developed method. By adding either methanol or ethanol, the recovery rate of OTA in aqueous solution was increased to more than 90%, and its concentration could accurately determined at an addition ratio of 1:1 by volume. It was demonstrated that B-1 (bacterium) and Y-2 (yeast) were able to degrade OTA. After incubation for two days, B-1 reduced 87% of OTA, and it was thoroughly degraded another day later. Y-2 showed similar ability to degrade OTA, with a degradation rate of 84% after two-day cultivation, and the concentration of residual OTA was stable in the following days. Moreover, LC-MS was used to detect OTA byproducts. Finally, through sequence analysis of the 16S rDNA and 5.8S internal transcribed spacer (ITS) ribosomal DNA (rDNA) regions, respectively, B-1 was identified as Brevundimonas vesicularis, while Y-2 as Yarrowia lipolytica.

ochratoxin A (OTA); recovery; degradation; microorganisms; screening; identi fication

TS262.6；TS201.6

A

1002-6630（2014）21-0154-05

10.7506/spkx1002-6630-201421030

2014-06-15

國家自然科學基金面上項目（31271967）；教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目（20123227110015）；鎮江市科技支撐計劃（農業）項目（NY1013004）

王峻峻（1987—），女，碩士，研究方向為水果的采后保鮮。E-mail：hmn23_44@126.com

*通信作者：張紅?。?972—），男，教授，博士，研究方向為水果的采后保鮮。E-mail：zhanghongyin126@126.com