高效液相色譜法檢測雞肉中替米考星藥物殘留的檢測與分析

曹忠君

（遼寧省鐵嶺市畜產(chǎn)品安全檢測站，遼寧 鐵嶺 112000）

高效液相色譜法檢測雞肉中替米考星藥物殘留的檢測與分析

曹忠君

（遼寧省鐵嶺市畜產(chǎn)品安全檢測站，遼寧 鐵嶺 112000）

本研究應(yīng)用高效液相色譜法對來自市場中64批次雞肉樣品進(jìn)行替米考星藥物殘留的檢測。結(jié)果表明，替米考星藥物殘留物在雞肉中的平均回收率為70.5%～92.3%。顯示該方法具有靈敏、快速的特點(diǎn)，符合現(xiàn)行獸藥殘留分析的要求。替米考星藥物殘留有一定檢出率，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管。

替米考星；雞肉；高效液相色譜法

替米考星（ti lmicosin，TIL）屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（macrol ide antibiotics，MALs），其分子式為C46H80N2O13，分子量為869.15。英國Elanco動物保健品公司在20世紀(jì)80年代開發(fā)成功。在巴西、馬來西亞、澳大利亞、法國、美國、西班牙等國家被批準(zhǔn)用于獸醫(yī)臨床。現(xiàn)已通過了我國農(nóng)業(yè)部獸藥評審委員會的嚴(yán)格審核，獲得國家三類新獸藥證書和批準(zhǔn)文號[1]。替米考星為中譜抗生素，其特征是抗革蘭氏陽性菌活性、抗支原體活性和低毒性，在雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中，用于預(yù)防和治療支原體病等。其危害是損害前庭和耳蝸神經(jīng)，導(dǎo)致眩暈和聽力減退。藥物在體內(nèi)蓄積達(dá)到一定的濃度，可造成肝腎的嚴(yán)重?fù)p害[2]。Kohanski等[3]通過試驗(yàn)證明，亞劑量的抗生素會導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生基因突變，從而發(fā)生單重或者多重耐藥性。雞肉中若存在亞劑量的抗生素，可利用選擇壓力方式，導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生突變，從而使其獲得抵御抗生素的能力。如果食用者食用含有耐藥菌株的雞肉后，有可能會發(fā)生耐藥菌株在體內(nèi)蓄積，倘若耐藥菌株把耐藥基因利用基因交換傳播給體內(nèi)的致病細(xì)菌，結(jié)果會使人體誘發(fā)嚴(yán)重疾病。我國農(nóng)業(yè)部于2002年12月24日發(fā)布了第235號公告，對動物性食品中獸藥最高殘留限量予以規(guī)定。其中，規(guī)定替米考星在雞肉中的最高殘留限量不得超過75μg/kg。

目前常用的測定動物性食品中替米考星及其活性代謝物殘留量的方法主要有酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析法、高效液相色譜法和紫外分光光度計(jì)法等。高效液相色譜法具有高效、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，是目前應(yīng)用最普遍的一種方法。

本研究旨在驗(yàn)證高效液相色譜法檢測雞肉中替米考星藥物殘留的可行性，也為了了解、調(diào)查某城市市場中流通雞肉替米考星藥物殘留的實(shí)際情況，為相關(guān)部門預(yù)防和治理食品安全問題提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備美國WATERS公司2695型高效液相色譜儀，配有2998二極管陣列檢測器；飛利浦公司HR2168型絞肉機(jī)；HITACHI公司CF160RXⅡ立式高速冷凍離心機(jī)；北京天平物華醫(yī)療儀器有限責(zé)任公司DT-200電子天平（感量0.01 g）；賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司CP225D型電子分析天平（感量：0.000 01 g）；德國IKA（廣州）儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司MS3(基本型)蝸旋混合器；昆山市超聲儀器有限公司KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器；天津市恒奧科技發(fā)展有限公司Type HSC-24A型24孔水浴加熱氮吹儀，連接純度99.9%以上氮?dú)猓唤K省金檀國華儀器廠HY-4型振蕩器；美國奧康公司24孔固相萃取裝置；Agela Technologies公司Cleaner t C18-SPE（500 mg/6 mL）固相萃取柱；Discovery C18（25 cm×4.6 mm，5μm）色譜柱；Thermo公司移液器（50μL、300μL、1 mL、10 mL 4種規(guī)格）。

1.2 試劑和材料替米考星（ti lmicosin，TIL）標(biāo)準(zhǔn)品（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），色譜純乙腈（Fisher公司），色譜純甲醇（Fisher公司），水為二次蒸餾水，磷酸二氫鉀，乙酸，乙酸銨，50 mL、100 mL規(guī)格聚乙烯離心管，0.5μm有機(jī)相微孔濾膜。

64批次雞肉樣品，分別于2013年下半年至2014年上半年不同時(shí)期在多個(gè)市場隨機(jī)抽取。樣品編號為：CM/CL001～CM/CL064。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品和溶液的配置 應(yīng)用感量為0.000 01 g的電子天平精確稱量替米考星約0.002 00 g，用乙腈稀釋定容至100 mL棕色容量瓶中，其濃度為：20μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存在2～8℃的冰箱中，有效期為3個(gè)月。應(yīng)用移液器精確吸取5.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用流動相稀釋定溶至10 mL容量瓶中，使其濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

磷酸二氫鉀緩沖液：稱取13.61 g磷酸二氫鉀溶解于800 mL蒸餾水中，用磷酸調(diào)pH至2.5，再用蒸餾水稀釋至1 000 mL；0.1 mol/L乙酸銨緩沖液（pH：5.0）：稱取38.55 g乙酸銨，用蒸餾水溶解定容至1 000 mL，再用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.0±0.2。

洗脫液（0.1 mol/L乙酸銨甲醇-乙腈，20+80，V/V）：稱取7.71 g乙酸銨溶解于200 mL甲醇中，加790 mL乙腈混勻，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至1 000 mL[4]。

1.3.2 樣品處理及提取 應(yīng)用絞肉機(jī)將約500 g雞肉樣品全部充分絞碎，量取5.0±0.05 g肉樣至50 mL聚乙烯離心管中，同法另取空白樣品兩份，其中一份空白樣品添加替米考星標(biāo)準(zhǔn)品。每個(gè)離心管中加乙腈5.0 mL，應(yīng)用蝸旋混合器將樣品充分混勻1 min，超聲波清洗器超聲3 min，振蕩器中速振蕩5 min，10 000 r/min離心10 min，收集上清液于100 mL離心管中。組織殘?jiān)僖来渭尤? mL磷酸二氫鉀緩沖液和乙腈，應(yīng)用蝸旋混合器將樣品充分混勻3 min，振蕩器中速振蕩10 min，10 000 r/ min離心10 min，合并2次上清液，加水30 mL充分混勻待凈化。

Cleaner t C18-SPE（500 mg/6 mL）固相萃取柱首先依次用甲醇、水各10 mL活化，上清液全部過柱，依次用10 mL水和乙腈淋洗，擠干。然后用洗脫液3.0 mL洗脫，擠干，收集洗脫液。將收集好的洗脫液于加熱至30℃的氮吹儀吹干。用1 mL流動相將吹干物復(fù)溶，充分渦旋1 min，最后經(jīng)0.5μm有機(jī)相微孔濾膜過濾，裝瓶待上機(jī)。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：Discovery C18（25 cm× 4.6 mm，5μm）色譜柱；流動相：0.1 mol/L乙酸胺緩沖液（乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.0±0.2）-乙腈-甲醇=（60+ 30+10，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30± 5℃；進(jìn)樣體積：50μL；檢測波長：290 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 計(jì)算公式

式中：X-樣品中替米考星殘留量（μg/kg），Ai-樣品溶液中替米考星的峰面積，C-標(biāo)準(zhǔn)工作液中替米考星的濃度（μg/mL），V-試樣定容體積（mL），f-樣品稀釋倍數(shù)，As-兩個(gè)平行標(biāo)準(zhǔn)工作液中替米考星峰面積的平均值，M-樣品的質(zhì)量（g）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

圖1 替米考星標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chrom atogram of tilm icosin standards

由圖1可以看出，替米考星組份的保留時(shí)間為14.518 min，其色譜峰分離完全，峰型狹窄、對稱，無拖尾、分叉、前沿現(xiàn)象。說明色譜條件良好，流動相配比適中，色譜柱效能高，標(biāo)準(zhǔn)品有效未分解。

2.3 方法回收率、精密度、批內(nèi)批間重復(fù)性和檢出限 回收率（RC）公式為：RC=空白添加樣品測定值/空白添加樣品添加值×100%。每次試驗(yàn)附加1批次空白樣品和1批次空白添加樣品（添加量為已知），見圖2、圖3對照比較，其替米考星組分的保留時(shí)間為14.628 min。在相同條件下連續(xù)平行測定5次，根據(jù)5次結(jié)果計(jì)算相對偏差。結(jié)果見表1，另測定不同來源的4批次陰性雞肉樣品的加標(biāo)回收率。每個(gè)樣品平行測定5次，各個(gè)批次平均加標(biāo)回收率均在70.5%～92.3%，批內(nèi)和批間的相對偏差見表1，回收率最大相對偏差小于10.0%。以3倍信噪比（S/N）計(jì)算，該方法的檢出限為10μg/kg。

圖2 空白添加替米考星高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of tilm icosin of recoveries

表1 數(shù)據(jù)分析表Tab le1 Data ana lysis table

圖3 空白樣品高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chrom atogram o f the blank sam ple

2.4 樣品結(jié)果分析見表2。

表2 雞肉中替米考星藥物殘留情況Tab le2 Tilm icosin residues in chicken

從表2可以看出，64批次雞肉樣品共有5批次檢出有替米考星藥物殘留，檢出率7.8%。在檢出的5批次樣品中含量均未超過我國農(nóng)業(yè)部第235號公告中對該類藥物最高殘留限量為75μg/kg的限量值。

3 討論與結(jié)論

通過對64批次雞肉樣品中替米考星藥物的檢測可以看出，應(yīng)用高效液相色譜法檢測替米考星藥物靈敏、高效、準(zhǔn)確，便于批量檢驗(yàn)。7.8%的高檢出率表明此類藥物在肉雞養(yǎng)殖中應(yīng)用普遍。有關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)對肉雞中抗生素殘留的監(jiān)測。5批次被檢出樣品均未超標(biāo)，說明待宰動物都執(zhí)行了休藥期的規(guī)定。但是，低濃度的抗生素殘留會很大程度上影響肉品質(zhì)，也將會引發(fā)更多的抗藥基因問題，對人類健康及生態(tài)環(huán)境造成潛在威脅。所以，有關(guān)部門應(yīng)指導(dǎo)合理使用抗生素，嚴(yán)格控制動物使用抗生素的休藥期，不定期監(jiān)督抽樣檢測替米考星等抗生素的殘留量。

[1]王煊，馬志強(qiáng)，王忠仁.動物專用抗菌藥—替米考星的簡介[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2012，（4）：241.

[2]劉勇軍.固相萃取-高效液相色譜法測定豬肉與雞肉中替米考星、泰樂菌素殘留量[J].肉類研究，2012，（12）：26.

[3]KOHANSKIMA，dePRISTO M A，COLLINSJJ.Sublethalantibiotic t reatment leads to mul tidrug resistance via radical-induced mutagenesis[J]. MolecularCel l，2010，37（3）：311-320.

[4]農(nóng)業(yè)部1025號公告-10-2008.

（編輯：郭雪峰）

Determ ination and Analysis of tilm icosin Drug residue in chicken by HPLC

Cao Zhongjun
（Tieling Livestock Product Safety Inspection Station，Liaoning Tiel ing 11200）

Ti lmicosin drug residue were tested f rom 64 chicken samples col lected f rom urban areas using HPLC method.The resul ts showed that recoveries for each analyte in chicken ranged f rom 70.5%～92.3%.This method is fast and sensitive,and can be used to simul taneously analyze residual of quinolones in actual samples.There is a relevance ratio of ti lmicosin residue,therefore Authorities should take it seriously.

Ti lmicosin;Chicken;HPLC

S859.84

：B

：1672-9692(2014)10-0013-04

2014-08-28

曹忠君（1979-），男，碩士，畜牧師，主要從事畜產(chǎn)品獸藥殘留檢測工作。