補體系統抑制劑聯合骨髓間充質干細胞移植用于修復脊髓損傷大鼠的研究

張海松，宋振全，梁國標，劉恩智

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴重危害人類健康的疾病，會嚴重影響患者勞動能力和生活自理能力，而且其治療時間長，花費也十分巨大，然而功能恢復卻不理想，一直是醫學界研究的難點和重點。傳統觀點認為中樞神經系統損傷后，由于內在的和外在的各種原因導致受損神經很難再生。目前，在脊髓損傷的諸多治療方案中，細胞移植一直是研究的重點之一［1，2］。然而單獨的細胞移植往往達不到理想的效果，仍需要藥物進行輔助治療與干預。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有分化成神經細胞的潛能，是骨髓中的造血結構性和功能性支持細胞，其用于治療脊髓損傷已取得一定進展［3，4］，但對于急性脊髓損傷伴隨的補體系統激活引起的損傷組織的中性粒細胞浸潤并從而加重繼發性損傷卻無能為力，導致治療效果欠佳;補體系統抑制劑(complement system inhibitor，CSI)則恰恰可以彌補這方面的缺陷［5，6］，二者的聯合移植值得關注。本研究將初步探索補體系統抑制劑與大鼠骨髓間充質干細胞聯合移植對于脊髓損傷模型大鼠的修復作用，為后續實驗奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 Wistar 大鼠BMSC 的分離、培養、標記取6 w 齡Wistar 大鼠15 只，重約100～150 g，雌雄不限。采用密度梯度離心、貼壁培養和酶消化控制相結合的方法，分離、培養、純化BMSC，每次傳代后在倒置顯微鏡下作形態學觀察與鑒定。傳至第6代，在移植前1 d 加入BrdU(3 mg/L)予以標記。移植前細胞計數，制成濃度約為4 ×106/ml 胞懸液。

1.2 補體系統抑制劑成分的制備 參考已報道［7］的方法應用多步沉淀及薄層層析方法進行草麻黃補體抑制成分的提純并進行活性鑒定。1 kg 草麻黃加入pH 4.0 的蒸餾水10 L 于室溫過夜，煮沸1 h后過濾除渣，加入1 mol/L NaOH 調整pH 至9.0，室溫攪拌，孵育1 h 至出現大量沉淀物，4000 r/min離心30 min 后棄上清，以pH9.0 蒸餾水及95%乙醇洗滌沉淀3 次，室溫烘干得到棕褐色粗品共18.5 g。取3 g 粗品溶于pH 4.0 的蒸餾水50 ml中，攪拌1 h 后過夜，煮沸1 h，2000 r/min 離心15 min，棄上清，溶于pH 9.0 的蒸餾水中。上述酸堿沉淀過程共3 次，最后所得沉淀物溶于10 ml 蒸餾水中，調整pH 值至4.0，進行薄層層析，紫外燈(254 nm)下觀察樣品分離情況。三段層析帶分割收集，以pH 4.0 的蒸餾水分別洗脫，洗脫液調pH 值至9.0，均出現沉淀。離心棄上清，微量法進行補體溶血實驗測定，結果證明最快速移動層析帶具有顯著的抗補體活性，主要作用于補體經典途徑及旁路途徑的C2 及C9 點位并進而有效抑制補體的聯級反應。重復以上步驟，共成功提取草麻黃補體抑制成分(ES)3.9 g，密封貯存備用。

1.3 聯合移植細胞懸液組 將上述濃度為4×106/ml 的BMSC 細胞懸液與1.5 g 補體抑制劑成分以100∶ 1 比例混合制成細胞懸液，作為聯合移植細胞懸液組。

1.4 SCI 動物模型的制作及分組 取雌性Wistar 大鼠100 只，以大鼠的T11 為中心，通過自制Allen 打擊架，制成重物打擊致脊髓全癱Allen 模型。傷后8 d，將制模大鼠隨機分為4 組，每組25 只;其中，A 組為BMSC 治療組、B 組為ES 治療組、C 組為空白手術組、D 組為BMSC+ES 聯合移植治療組。

1.5 移植方法 用微量進樣器抽取6 μl 細胞懸液，在立體定位儀下分別于損傷區中心及遠、近端各1 mm 處3 點注射，進針深度為1 mm，注入細胞后針頭在脊髓內停留1.5 min 后抽出。空白對照組:注射同體積的培養基。然后依次縫合肌肉及皮膚。

1.6 術后護理 麻醉蘇醒后分籠飼養，術后3 d應用抗生素。每天依次進行膀胱按摩擠尿，并翻身防止褥瘡發生。術后每隔1 w 稱量體重并進行監控。

1.7 灌注、固定、取材、染色移植后的1、3、5 w，每組隨機取10 只大鼠，4%多聚甲醛心內灌注、固定、取材，石蠟包埋，連續切片，片厚5 μm，蘇木素-依紅(HE)染色、觀察［8］。

1.8 各組大鼠雙后肢的運動功能觀察 各組大鼠分別于移植后的7 w 內每周放在100 cm ×150 cm 的開放空間，采用BBB 后肢功能評分標準［9］，3人、雙盲獨立觀察大鼠雙后肢的運動功能并記錄。

1.9 BMSC 存活免疫組織化學觀察及計數分別取注射后1、3、5 w 各組標本切片各10 張，先后加入Ⅰ抗(BrdU 小鼠抗大鼠)和Ⅱ抗(小鼠IgG)，DAB 顯色后觀察。在100 倍放大條件下，用Nikon ECLIPSE E600 計算機圖像分析儀和Image-pro-plus(4.5)圖像分析軟件，按文獻Lee 法［7］計數每個標本各個時間點BrdU 陽性細胞數的均值以()表示，并計算其占細胞移植數的百分率。

1.10 過氧化物酶(MPO)活性 各組動物于傷后每個時間點各取5 只再次麻醉，以傷處為中心取1 cm 脊髓組織，置于液氮中保存，稱重后剪碎。加入含0.5%溴化十六烷基三甲胺的磷酸鹽緩沖液中勻漿［9］，超聲細胞粉碎儀粉碎后再于4 ℃下孵育30 min，12500 r/min 離心30 min，取上清液0.1 ml，按ELISA 測試盒方法進行后續實驗。

1.11 統計學方法 采用單因素方差分析法比較組間差異。

2 結果

2.1 術后大鼠體重變化 術后大鼠體重均出現不同程度的減輕，且2 w 內體重減輕明顯，4 w 時大鼠體重開始增加(見表1)，細胞移植組與空白對照組比較差異有統計學意義。

2.2 各組大鼠后肢功能BBB 評分結果 打擊術前大鼠BBB 評分均為21 分，術后1 d 各組大鼠雙后肢功能喪失，足底向上呈不負重拖動或足置于不負重位，主要靠前肢拖動身體移動，腹部貼地，大小便失禁，BBB 評分均為0 分，術后7 d 細胞移植組大部分大鼠恢復自主膀胱，2 w 內所有大鼠均可自行排尿。BBB 運動評分具體結果(見表2)。移植后從2 w 開始，各組的BBB 評分由高到低排列順序為D＞A ＞B ＞C 組(P ＜0.05)。

2.3 BMSC 存活及計數觀察結果 對于A、B、D 組，移植后1 w 在損傷灶內及損傷灶臨近節段的脊髓內可見大量大小不一、呈圓形或橢圓形、胞體較大、藍色表達于細胞漿的BrdU 陽性細胞，主要分布于灰、白質;在距損傷灶鄰近節段脊髓白、灰質內，陽性細胞數明顯減少;移植后3 w 損傷段脊髓內仍可見較多BrdU 陽性細胞，但在灰質內的細胞數量明顯少于白質;移植后5 w 脊髓內的BrdU 陽性細胞數量減少。D 組移植后1 w 約有(9210 ±652)個BrdU陽性細胞，約占移植細胞數量的7.0%;移植后3 w約有(7923 ±677)個BrdU 陽性細胞，約占移植細胞數量的6.2%;移植后5 w 約有(5822 ±692)個BrdU陽性細胞，約占移植細胞數量的5.1%。A 組移植后1 w 約有(7110 ±552)個BrdU 陽性細胞，約占移植細胞數量的5.8%;移植后3 w 約有(5243 ±517)個BrdU 陽性細胞，約占移植細胞數量的4.2%;移植后5 w 約有(4850 ±545)個BrdU 陽性細胞，約占移植細胞數量的3.5%。B 組移植后1 w 約有(7020±465)個BrdU 陽性細胞，約占移植細胞數量的5.5%;移植后3 w 約有(5106 ±434)個BrdU 陽性細胞，約占移植細胞數量的4.1%;移植后5 w 約有(4341 ±448)個BrdU 陽性細胞，約占移植細胞數量的3.2%。C 組損傷段脊髓及鄰近節段內未見有BrdU 陽性細胞。

2.4 過氧化物酶(MPO)活性測定結果 傷后12 h，各組MPO 活性開始增高，分別為0.7824 ±0.085、0.8954 ±0.101、0.8636 ±0.091 和0.7786 ±0.103 (P ＜0.05);傷后3 d 達到高峰，分別達到1.8824 ±0.125、1.3064 ±0.141、1.9243 ±0.121 和1.2123 ±0.132(P ＜0.01)，之后隨著時間延長活性逐漸減弱，存在一個動態變化過程。B 和D 組在傷后3 d 起MPO 活性均弱于A 和C 組，差異具有顯著性意義(P ＜0.01)。

表1 術后各組大鼠不同時期體重變化情況(，n=25)

表1 術后各組大鼠不同時期體重變化情況(，n=25)

與空白組比較* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

表2 術后各組大鼠不同時期BBB 運動功能評分表(，n=25)

表2 術后各組大鼠不同時期BBB 運動功能評分表(，n=25)

D 組與A 組比較* P ＜0.05;D 組與B 組比較△P ＜0.01;與C 組比較#P ＜0.01

3 討論

SCI 可以激發機體并引起損傷脊髓組織強烈的免疫炎性反應。此過程包括中性粒細胞、單核細胞等向損傷處浸潤、膠質細胞的活化、炎性介質的產生及代謝產物堆積;還可使血管發生痙攣，血管內皮變性、水腫、出血或血小板凝集、血栓形成等，造成局部微循環障礙，從而使損傷脊髓缺血范圍不斷擴大、損傷程度不斷加重［10～12］。

從嚴格意義上來講，SCI 后免疫炎癥反應是一把雙刃劍。一方面該過程可以清除壞死組織，促進組織細胞增生和創面修復，這是機體損傷后修復的基本過程，是一種普遍的防御和保護機制［13］。另一方面，嚴重的創傷如脊髓損傷時存在過度的炎癥反應，這將導致脊髓組織進一步的損傷，妨礙脊髓組織的修復和神經元的再生，導致神經元、神經膠質細胞等繼發性的壞死和凋亡，從而阻礙損傷后神經功能的恢復，最終導致臨床結果的惡化，而這一方面往往更為重要［14，15］。在對大鼠SCI 模型的研究中發現，SCI組織中的中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞的數量與繼發性SCI 程度密切相關，提示抑制損傷后的炎癥反應可顯著地減輕神經組織的損害。在本研究中，組織病理學檢查結果也顯示，大鼠SCI 后損傷組織中的炎癥反應存在動態變化過程，實驗組的中性粒細胞浸潤、神經元腫脹變性等均輕于對照組，提示ES 的干預治療對損傷后的免疫炎癥有抑制作用。免疫炎癥反應參與繼發性脊髓損害已經越來越得到人們的共識，而通過各種途徑抑制SCI 后的炎癥反應已經成為SCI 實驗性及臨床性治療的一個重要策略及熱點方向［16，17］。在急性免疫炎癥反應過程中，中性粒細胞是主要的炎癥細胞，也是第一個到達損傷組織的炎癥細胞［18］。MPO 主要是中性粒細胞胞漿顆粒中的一種特異性酶，每個細胞所含酶約為細胞干重的5%，其活性的高低可代表中性粒細胞的數量和活性［19，20］。我們動態檢測大鼠SCI 后脊髓組織的MPO 活性，以明確SCI 后中性粒細胞活性狀態，并比較實驗組及對照組傷后不同時間點MPO 活力差異。結果表明，B 和D 組在各個時間點MPO 活性均顯著弱于A 和C 對照組，表明補體抑制劑ES 對SCI 組織中MPO 活性有顯著抑制作用，即對免疫炎癥反應的抑制作用較強。結合上述其他實驗結果，不難看出，補體系統抑制劑聯合骨髓間充質干細胞移植用于修復脊髓損傷大鼠效果較好，既可以增強神經細胞的再生能力又可以抑制其繼發的免疫炎癥反應，從而大大提高了治療效果。

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