金線吊烏龜的組織培養與快速繁殖技術研究

苗 爽， 袁卓婷，王長春，胡海濤

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江 金華 321004）

金線吊烏龜（Stephania cepharanthaHayata）為防己科千金藤屬多年生草質落葉藤本植物，其塊根為民間常用草藥，稱白藥、白藥子或白大藥，味苦性寒，有清熱解毒、消腫止痛之功效，常用于治療癰疽腫毒、腮腺炎、毒蛇咬傷等[1-2]。現代藥理學試驗表明，金線吊烏龜塊根中含有多種生物堿[3-4]，具有多種臨床藥理活性，如增強免疫調節、促進血管舒張、抗HIV-1、抗癌、抑制過敏性休克等功效[5-7]。隨著藥理學研究的深入，金線吊烏龜的開發應用和物種資源保護的矛盾將日益突出，開展金線吊烏龜的組培快繁非常必要。研究以種質快繁為目的，對金線吊烏龜組培快繁關鍵技術開展研究，以期為其種質資源的保護，以及其開發利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

金線吊烏龜的植株采自湖南衡山，種植在浙江師范大學生物園內。取其幼嫩的帶腋芽莖段，去除葉片，先用清潔劑清洗，再用流水沖洗1 h，在超凈工作臺上用75 %乙醇處理1 min，0.1% HgCl2溶液處理10 min，再用無菌水清洗5次，將莖段切成長約2.0 cm的帶腋芽莖段，接種到腋芽誘導培養基上。

1.2 培養基及培養條件

腋芽誘導培養基：1/2 MS+5 μmol/L KT+0.5 μmol/L NAA。繼代增殖培養基：1/2 MS+（1.0、5.0、10.0、20.0）μmol/L KT +0.5 μmol/L NAA；1/2 MS+（1.0、5.0、10.0、20.0）μmol/L 6-BA+0.5 μmol/L NAA。生根培養基：1/4 MS+（1.0、5.0、10.0、20.0） μmol/L NAA+1.0 g/L活性炭。附加蔗糖30 g/L、瓊脂粉6 g/L，pH值5.8，配制分裝后，121℃滅菌20 min。培養溫度為（26±2）℃，光照強度1 500 lx，光照時間16 h/d。

1.3 芽的增殖培養

取健壯、無菌的試管苗，剪成2.0 cm的帶節小段，接種到增殖培養基中，每個處理接種6瓶，每瓶接種6個芽，定期觀察記錄，30 d統計叢生芽增殖系數。增殖系數的計算采用平均從一個芽上產生的新芽數。根據增殖系數分析各因素、各水平差異顯著性，并對效果顯著的因子做多重比較。

1.4 生根培養

選用苗高5 cm左右的小苗進行生根培養，每種處理6瓶，每瓶接種6株，3次重復，30 d統計生根情況。

1.5 生根苗的煉苗與移栽

生根培養基中培養30 d后，苗高5～8 cm、根系發達的生根苗，預先室內開蓋煉苗3 d，小苗從培養瓶中取出后，用清水洗去根部殘留的培養基，栽植于下列基質中，種后澆透水，適當保濕遮陰，30 d后統計成活率。

2 結果與分析

2.1 不同激素濃度配比對金線吊烏龜叢生芽增殖的影響

從表1中可以看出，在金線吊烏龜的組培快繁試驗中， 6-BA對金線吊烏龜離體培養可能有毒害作用，即便在低濃度下也影響芽的誘導和增殖。KT為適宜的細胞分裂素，在添加KT的培養基上，叢生苗長勢比較好，而且隨著KT濃度的增加芽增殖倍數也相應提高，但KT濃度達20.0 μmol/L以上時誘導出的芽出現玻璃化現象。因此綜合考慮，10 μmol/L KT，0.5 μmol/L NAA為適宜金線吊烏龜增殖培養的激素組合。

表1 不同激素濃度配比對金線吊烏龜叢生芽的增殖效果Table 1 Multiplication effects of different concentrations of hormones on cluster shoots of Stephania cepharantha Hayata

2.2 不同濃度的CCC對金線吊烏龜壯苗的影響

在離體培養中，生長抑制劑類物質可以使苗木矮化健壯，抑制過高生長，對培育壯苗、提高試管苗質量具有較好的效果。在1/2 MS+10 μmol/L KT+0.5 μmol/L NAA為基本培養基，附加不同濃度的CCC，培養30 d后，觀察到不同濃度CCC處理均對試管苗的生長有抑制作用，且抑制作用隨濃度增加而增強，植株明顯變矮，葉色逐漸加深，苗木逐漸變粗，使用濃度以20.0 μmol/L CCC效果最好（見表2）。

表2 不同濃度CCC對金線吊烏龜壯苗的效果Table 2 Effects of different concentrations of CCC on strong shoots of Stephania cepharantha Hayata

2.3 不同濃度的NAA對金線吊烏龜生根的影響

表3顯示，培養基中不同濃度的NAA對金線吊烏龜不定根誘導影響比較明顯，生根率及根數隨NAA濃度增高而升高，其中不加激素的培養基不能誘導生根，在15號培養基中的芽生根率為100%，平均根數為4.3條。雖然在16號培養基上接種的芽生根率比在15號培養基接種的芽生根率平均根數高，但誘導出來的根有部分表現出生長不正常，因此選擇15號培養基作為金線吊烏龜的生根培養基。

表3 不同濃度NAA對金線吊烏龜生根的影響Table 3 Effects of different concentrations of NAA on plantlet rooting of Stephania cepharantha Hayata

3 小結與討論

在建立經濟植物組培快繁體系的研究中，為了達到快速繁殖的目的，通常需要在培養基中添加一定質量濃度的植物激素，培養基中添加的植物激素種類和濃度是決定組培快繁體系成功的關鍵。6-BA是經濟植物組培快繁體系中常用的細胞分裂素，廣泛應用于大多數植物組培快繁殖研究中，無論是誘導腋芽的萌動成苗，還是試管苗的增殖。然而在金線吊烏龜組培快繁中，發現6-BA的生物學效應與其在其他植物材料上的有明顯區別。在添加了不同濃度6-BA的叢生芽增殖培養基上都不能誘導出叢生芽，即便是在較低濃度下，也出現新芽萎縮、難以伸長、難以長高等癥狀，嚴重影響金線吊烏龜植株的生長。黃寧珍等[8]在金線吊烏龜的同屬植物廣西地不容的組培快繁殖中也發現了類似的現象。一系列篩選試驗表明，在金線吊烏龜的繼代增殖過程中KT的效果明顯優于6-BA，誘導出的叢生芽長勢良好。在培養基中適當添加CCC能顯著改善金線吊烏龜試管苗的品質，經適量質量濃度CCC處理，有利于金線吊烏龜形成壯苗及有效嫩莖的比例，可以提高金線吊烏龜的生根數量和移栽成活率。

試驗以金線吊烏龜莖段作為外植體，獲得了較高的增殖系數、生根率和移栽成活率，篩選出了金線吊烏龜快繁過程中各個階段所需的適宜培養基，最佳叢生芽增殖培養基為1/2 MS+ 10 μmol/L KT + 0.5 μmol/L NAA+ 20 μmol/L CCC，芽苗生根的最適培養基為1/4 MS+ 10 μmol/L NAA 。該組織培養與快繁技術體系為金線吊烏龜快速育苗提供了技術支持。

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志[M]. 北京：科學出版社，1996.

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