移植Noggin 基因修飾的神經干細胞對于大鼠MCAO 模型梗死區域生長相關蛋白GAP-43 MAP-2 表達的影響

李雙佳，朱曉峰

Noggin 是一種重要的胚胎蛋白發育基因［1］，廣泛參與神經系統和骨骼的發育、毛發的生長、心臟中隔的形成［2，3］。有研究表明，Noggin 基因可以通過誘導神經再生和局部新生發揮對腦缺血損傷的保護作用［4］。

本實驗通過構建重組pEGFP-N1-Noggin 真核表達載體，轉染神經干細胞，建立大鼠MCAO 局灶性腦缺血模型，進行神經干細胞移植治療，觀察Noggin對神經干細胞對微管結合蛋白MAP-2、生長相關蛋白GAP-43 表達的影響，并對大鼠MCAO 模型進行評分，探討Noggin 對神經功能恢復的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 新生24 h 之內Wistar 鼠仔，由佳木斯大學動物實驗中心提供。重組大鼠pEGFP-N1-Noggin 質粒由佳木斯大學基礎醫學院生物學教研室劉爽博士惠贈。Lipofectamine 2000 購自Invitrogen公司。兔抗大鼠Nestin 抗體、兔抗大鼠GAP-43 抗體、兔抗大鼠MAP-2 抗體，購自Santa Cruz 公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠神經干細胞(NSCs)的分離培養［5］常規分離新生Wistar 大鼠海馬，D-Hanks 液漂洗后充分剪碎，吸管吹打成單細胞懸液，以5×105/L 密度接種于NSCs 完全培養液(含DMEM/F12、bFGF、EGF、B27 和青鏈雙抗)，5%CO2孵箱中培養，3 d后離心、半量換液，繼續培養到7 d，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待形成大量100～200 個細胞左右的NSCs 球時，進行胰酶消化傳代。細胞免疫熒光染色法檢測神經干細胞特異性抗原Nestin 表達。

1.2.2 重組質粒PEGFP-N1-Noggin 轉染大鼠NSCs 轉染方法參考文獻［6］及Lipofectamine 2000說明書。瞬時轉染2 d 后，按1/10 比例傳代，次日改用含G418(800 μg/ml)及10%胎牛血清的MEM培養液篩選，維持培養，3～5 d 換液一次，約7 d 左右陰性對照細胞全部死亡，將G418 濃度降為200 μg/ml 的維持濃度，約14 d 后出現細胞克隆。挑取陽性克隆擴大培養，命名為Noggin 組和空載組，分別擴大培養，傳代建系。激光共聚焦顯微鏡檢測重組PEGFP-N1-Noggin 基因表達和Nestin 表達。

1.2.3 大鼠MCAO 模型的建立及鑒定 大鼠MCAO 模型的建立和具體操作參照線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的改進方法［7］。大鼠MCAO 模型的鑒定參照Zea-Longa 方法在大鼠手術麻醉清醒后進行5 分制評分，評分標準:0 分:無神經功能損傷癥狀;1 分:動脈栓塞對側前爪不能完全伸展;2分:行走時向動脈栓塞的對側旋轉;3 分:行走時向栓塞動脈的對側傾倒;4 分:不能自主行走，意識喪失。評分為以1～3 分者入選。TTC 染色:造模后2 d，大鼠以10%水合氯醛過量麻醉后仰臥位固定，快速開胸暴露心臟，從心尖部將16 號針頭插至主動脈根部，血管鉗夾閉腹主動脈，剪開右心耳放血。經心臟快速灌注4 ℃生理鹽水250 ml 左右，直至流出液變清。立即斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，－20 ℃冰箱內冷凍20 min 后連續切成厚2 mm的冠狀切片，約6～7 片。將其放入預先配制的2%TTC 溶液中，37 ℃避光孵育30 min，15 min 時腦片翻面一次，使均勻接觸到染色液。30 min 后觀察拍照，正常組織呈鮮紅色，壞死區不染色而呈蒼白色。

1.2.4 動物分組及移植 將具有神經功能缺失癥狀的大鼠隨機分為3 組:(1)生理鹽水移植組(NS組)(18 只，每個時間點6 只);(2)神經干細胞/空載體移植組(空質粒/NSCs 組)(18 只，每個時間點6只);(3)神經干細胞/Noggin 移植組(NOG/NSCs 組)(18 只，每個時間點6 只)。3 組按照移植時間(2 d、7 d、14 d)不同分為3 個亞組，每個時間點6 只。利用大鼠腦立體定位儀進行腦內移植，移植時間為成模后3 d，移植部位為左側腦室(前囪后0.8-1.0 mm，頭尾正中線右側旁開1.8～2.0 mm，深度4.0～5.0 mm)。

1.2.5 大鼠神經干細胞移植后腦缺血組織MAP-2、GAP-43 免疫組化檢測 分別于NSCs 移植后2 d、7 d、14 d 后，將大鼠麻醉后開胸，4 ℃4%多聚甲醛固定液250 ml 心臟灌注，灌注后快速取腦，并置于相同固定液中4 ℃固定24 h，常規石蠟包埋，于前囪后1.5 mm 處冠狀位連續切片，切片厚度為6 μm，SABC-DAB 法免疫組化染色，免疫組化染色后于光學顯微鏡下觀察，以缺血梗死組織周邊2 mm范圍內出現細胞胞漿曾棕色表達為陽性細胞，每張切片在×200 鏡下分別隨機選區5 個視野，并計數視野內的陽性細胞。

2 結果

2.1 原代培養NSCs 形態學觀察 倒置顯微鏡下觀察原代培養海馬NSCs 單細胞懸浮生長，密度較均勻;2 d 后發現NSCs 自身克隆，以后克隆逐漸增大;到3 d 聚集成圓球形，漂浮生長于培養瓶中，折光性好，大小不等;到7 d 克隆到數百個細胞，形成神經球。此刻的神經球立體感及折光性均強，邊界清晰。組成神經球的細胞圓潤飽滿，活力狀態好。細胞免疫熒光染色可發現傳代培養神經球有Nestin 陽性表達。

2.2 重組PEGFP-N1-Noggin 基因轉染大鼠神經干細胞觀察 共聚焦顯微鏡檢測重組PEGFP-N1-Noggin 基因轉染大鼠神經干細胞綠色熒光蛋白表達和Nestin 表達，共聚焦顯微鏡下綠色熒光蛋白為綠色，Nestin 表達為紅色，兩者重合為黃色，結果顯示PEGFP-N1-Noggin 轉入Nestin 標記的神經干細胞內。

2.3 PEGFP-N1-Noggin 基因轉染大鼠神經干細胞移植對大鼠腦缺血后免疫組化檢測生長相關蛋白GAP-43 及微管結合蛋白MAP-2 在腦內梗死灶周圍的表達。

2.3.1 移植后2 d、7 d、14 d 各組免疫組化檢測生長相關蛋白GAP-43 在梗死灶周圍的表達 免疫組化檢測NOG 組、空質粒組GAP-43 的蛋白表達，陽性細胞表達呈棕色，免疫組化顯示GAP-43 蛋白表達于胞漿和胞膜，呈棕褐色。梗死中心區無明顯陽性染色，梗死周圍可見陽性表達。陽性率=陽性細胞數/總細胞數(個/×200 視野)×100%。移植后2 d、7 d、14 d 各組GAP-43 的表達逐漸增高，移植后2 d 表達為最低，在14 d 時表達最高，各時間點差異有統計學意義(P＜0.05)(見表1);組間比較顯示NOG 組GAP-43 各個時間點表達最高，NS 組GAP-43 表達最低(見表2)。

2.3.2 移植后2 d、7 d、14 d 各組免疫組化檢測微管結合蛋白MAP-2 在梗死灶周圍的表達 免疫組化檢測NOG 組、空質粒組MAP-2 的蛋白表達，陽性細胞表達呈棕色，陽性率=陽性細胞數/總細胞數(個/×200 視野)×100%。MAP-2 陽性表達反應主要位于神經元和樹突，以樹突表達尤為明顯。染色均勻，突起排列完整呈束狀。腦缺血后中心區幾乎無表達，樹突排列不齊，呈散在、斷裂狀，周邊區表達增強，粗大深染樹突增多，可見部分正常神經元和樹突形態排列完整者與缺血神經元相交織。移植后48 h、7 d、14 d NOG 組、空質粒組的MAP-2 蛋白顯著高于NS 組(P＜0.05);并且NOG 組MAP-2 蛋白的表達顯著高于空質粒組(P＜0.05);各組內各時間點MAP-2 的蛋白表達于移植后2 d、7 d、14 d 逐漸增高各時間點差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 各組不同時間點GAP-43 蛋白的表達率(±s)%

表1 各組不同時間點GAP-43 蛋白的表達率(±s)%

與NS 組比較* P＜0.05，△P＜0.01;與空質粒組▽P＜0.05

表2 各組不同時間點MAP-2 蛋白的表達率(±s)%

表2 各組不同時間點MAP-2 蛋白的表達率(±s)%

與NS 組比較* P＜0.05，△P＜0.01;與空質粒組▽P＜0.05

3 討論

實驗中應用NOG 基因修飾的外源性NSCs 移植治療大鼠局灶性腦缺血的目的是為了探討Noggin基因對大鼠局灶性腦缺血后生長相關蛋白GAP-43及微管相關蛋白MAP-2 表達的影響。Noggin 基因作用腦缺血組織機制可能為內源性神經誘導作用:Noggin 基因是一種胚胎蛋白，對神經干細胞分化有重要調控作用，調控成體中樞神經系統神經發生。內源性神經誘導作用Ngogin 的神經誘導功能主要與其對骨形態發生蛋白BMPs 的抑制作用有關［9］。骨形態發生蛋白屬于轉化生長因子-β(transfomring growth factor bate，TGF-β)超家族，BMPs 是家族成員中最大的一族，至少包括20 個成員，其成員控制著如中胚層形成、左右對稱、神經系統發生、體節和骨骼發育、肢體形成和腎、胃腸、肺、牙齒的發育等基本的發育過程［10，11］，包括發育期和成年后的各個時期［12］。Lim 證實，Noggin 與BMP4 共同調控成年室下區神經干細胞的分化［13］。在體內與離體研究均證實BMPs 可以明顯抑制神經發生，BMPs 信號通過促進室下區神經干細胞向膠質細胞分化，而抑制神經元的產生，純化的小鼠Noggin 蛋白則促進離體神經發生并抑制向膠質細胞分化。異位Noggin 促進移植入紋狀體室下區細胞向神經元方向分化生。提示室管膜Noggin 產生通過封閉內源性BMPs 信號為鄰近的室下區細胞提供了促進神經發生的環境。

3.1 Noggin 對GAP-43、MAP-2 表達的影響生長相關蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)又稱作神經調節蛋白(neuromodulin，NeM)，是一種神經組織特異性磷酸蛋白，分子量約為46.7 kDa，分布于神經元、再生的施旺細胞和神經膠質細胞，參與神經細胞生長及突觸發育形成、神經細胞再生和突觸重構。在突觸重建過程中，新生發芽末梢中GAP-43 含量顯著增高，只要有突觸重建，即使無軸突延伸，GAP-43 也會在高水平上表達。一旦突觸重建完成，GAP-43 mRNA 就下降至微量或無表達。因此，GAP-43 被認為是神經元生長發育、神經再生以及成熟中樞神經系統中突觸重建和可塑性的分子標志物［14］。我們在實驗中發現，轉染Noggin 的神經干細胞移植組在移植后大鼠腦梗死灶周圍區GAP-43 表達較其他組顯著增加，提示Noggin 可以促進梗死灶內移植細胞和周圍細胞的生長發育、神經再生以及成熟中樞神經系統中的突觸重建。

近年研究表明，微管結合蛋白-2(MAP-2)在神經元發育、分化、可塑性方面起著主導作用。MAP-2主要存在于樹突和胞體，是細胞骨架結構蛋白，對腦缺血非常敏感，常作為缺血誘導腦缺血損傷的標記物，也有實驗觀察到MAP-2 可調節突觸可塑性。研究顯示中樞神經系統具有高度的可塑性，主要為神經元結構和功能的適應性變化。已證實可塑性存在于神經元發育早期和成年后突觸構成時期，與樹突及突觸的形態學變化有關，并受MAP-2 磷酸化狀態的調節，提示細胞骨架蛋白在神經可塑過程中有重要作用［15］。研究表明，腦缺血后梗死中心區受損神經元MAP-2 表達喪失，而相對完整的神經元和缺血周邊區MAP-2 表達選擇性升高，此種改變與缺血后的神經元恢復相對應［16］。因此，MAP-2 可以作為促進神經元生長發育、神經再生以及成熟中樞神經系統中突觸重建和可塑性的分子標志物，研究發現轉染Noggin 的神經干細胞移植組，移植后大鼠腦梗死灶周圍區MAP-2 表達較其他組顯著增加，提示Noggin 可以促進梗死灶內移植細胞和周圍細胞MAP-2的表達，促進神經元生長發育、神經再生以及成熟中樞神經系統中突觸重建。

3.2 移植Noggin 基因轉染的神經干細胞治療局灶性腦缺血的應用前景 Noggin 基因在中樞神經系統中的多重功能提示其在中樞神經系統損傷的治療方面有一定的應用前景。轉染了Noggin 基因后，由于Noggin 發揮內源性神經誘導作用可增強神經干細胞移植治療局灶性腦缺血的作用。我們應用Noggin 基因修飾的NSCs 移植，可以促進腦損傷區域生長相關蛋白-43 及微管結合蛋白-2 表達，促進營養神經再生的蛋白質類合成條件［17］。雖然NSC移植治療缺血性腦損傷所致的神經功能障礙還有很多問題需要解決，但NSCs 移植和轉基因治療已經在動物模型研究中取得了一定進展，說明這是一種有著廣闊前景的治療策略，為某些難治性神經系統疾病帶來了希望。

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