牛乳樣本中布魯菌的核酸檢測及風險評估

白 璧，余彬輝，方 英，藺俐仲，徐春志，楊 峰，陳 紅，彭 屹，袁翠霞

（1.貴陽市動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽550081；2.杭州薦量獸用生物制品有限公司，浙江 杭州310000；3.貴陽市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，貴州 貴陽550081）

布魯菌病（Brucellosis）是由布魯菌（Brucella）侵入機體引起的重要人畜共患病。該病廣泛分布于世界各地，我國也有著廣泛的流行區(qū)域，較為嚴重的是近年來布魯菌病發(fā)病呈上升趨勢[1]。據(jù)報道，截止2009年全國29個省（區(qū)、市）發(fā)生畜間布魯菌病，牛、羊、豬感染達百萬頭之多，人間布魯菌病2009年全年新增病例3.7萬例，世界范圍內(nèi)每年出現(xiàn)約50萬例人間布魯菌病[2]。由于該病危害大、流行廣，不僅影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展，也嚴重威脅人類健康，是目前世界上嚴重的公共衛(wèi)生問題之一[3]。

目前，布魯菌病的防控措施主要以撲殺和疫苗免疫接種為主，但由于接種布魯菌病疫苗均為弱毒活疫苗，對人體健康具有一定的危害作用。本試驗為了掌握奶牛接種布魯菌活疫苗后是否通過乳汁排菌，采用套式PCR方法對某接種過疫苗的奶牛場牛乳進行檢測，并對檢測為陽性的牛乳樣本進行了豬種和牛種布魯菌的鑒別及病原菌分離，現(xiàn)將試驗結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 牛乳樣本 234份牛乳樣本采自貴陽市某接種過S2株布魯菌活疫苗的規(guī)模化奶牛場。

1.2 菌種和主要試劑 S2株布魯菌活疫苗和A19株牛流產(chǎn)布魯菌活疫苗，購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司；SDS、蛋白酶K、酚/氯仿/異戊醇、dNTP、Taq DNA聚合酶、200 bp DNAMarker、布氏瓊脂、放線菌酮、萬古霉素、多粘菌素B、桿菌肽等試劑，均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物的合成 參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《奶牛布魯菌病PCR診斷技術(shù)》（NY/T 1467-2007），針對布魯菌外膜蛋白25基因（OMP25）合成兩對特異性引物Bp1/Bp2和Bp3/Bp4，預期擴增長度419 bp；參照中國農(nóng)業(yè)科學院李艷等[4]發(fā)表的文獻，針對布魯菌外膜蛋白2基因（OMP2）合成兩對特異性引物S1/S2（檢測豬種布魯菌，預期擴增長度535 bp）和A1/A2（檢測牛種布魯菌，預期擴增長度285 bp），引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，序列如下：

Bp1：5，-CGTGCCGCAATTACCCTC-3；

Bp2：5，-CCGTCAGCTTGGCTTCGA-3；

Bp3：5，-GATGCTGCCCGCCCGATAA-3；

Bp4：5，-GCACCGAGCGAGCCTTGAAA-3；

S1：5，-GGCGGCGACGACGTTTAT-3；

S2：5，-CCGGGTCATAGGCAACAG-3；

A1：5，-GGCGATTTCAGCGATGAT-3；

A2：5，-GAACCGGTCGGTGATGTT-3。

1.4 布魯菌總DNA的提取 取牛乳樣本500μL，分別加入SDS和蛋白酶K至終濃度為5 g/L、200μg/mL，56℃水浴1 h；加等體積酚/氯仿/異戊醇，反復顛倒數(shù)次，12 000 r/min離心10min；取上清，加等體積氯仿/異戊醇，反復顛倒混勻，12 000 r/min離心10min；取上清，加1/10體積醋酸鈉（NaAc）和2.5倍體積預冷無水乙醇，-20℃靜置2 h，12 000 r/min離心10min；棄上清，70%乙醇洗滌并干燥后，適量緩沖液（TE）溶解備用。

1.5 PCR擴增 參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術(shù)》（NY/T 1467-2007）中的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行，同時以S2株布魯菌活疫苗作為陽性對照，滅菌雙蒸水作為陰性對照。

1.6 布魯菌種的鑒別 參照中國農(nóng)業(yè)科學院李艷等發(fā)表的文獻進行豬種和牛種布魯菌鑒別。

1.7 布魯菌病原分離 制備1 000mL（含10%馬血清）布氏瓊脂，向其中無菌添加放線菌酮100 mg、萬古霉素25 000 IU、多粘菌素B 6 000 IU和桿菌肽25 000 IU，制備布魯菌選擇性培養(yǎng)基。取PCR檢測為陽性的牛乳樣本在布氏瓊脂平板上直接劃線分離病原菌，置10%二氧化碳、37℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 牛乳樣本布魯菌的核酸檢測結(jié)果 采用SDS-蛋白酶K法提取的牛乳DNA樣本以套式PCR方法進行擴增，結(jié)果：234份牛乳樣本經(jīng)套式PCR擴增后，其中18份樣本擴增出一條419 bp的DNA條帶，與S2株布魯菌活疫苗的擴增片段相一致，而滅菌雙蒸水顯現(xiàn)陰性反應(yīng)，擴增結(jié)果見圖1。即在奶牛接種過S2株布魯菌活疫苗后乳汁中布魯菌核酸檢出率為7.69%（18/234）。

圖1牛乳樣本的PCR擴增

2.2 布魯菌種的鑒別結(jié)果 取上述18份布魯菌核酸陽性乳DNA樣本，分別以S1/S2和A1/A2引物進行擴增，同時以S2株布魯菌活疫苗、A19株牛流產(chǎn)布魯菌活疫苗作為陽性對照，滅菌雙蒸水作為陰性對照。在18份布魯菌核酸陽性乳樣本中，9份樣本S1/S2引物擴增出一條535 bp的DNA條帶，系檢出豬種布魯菌核酸；其中1份樣本S1/S2、A1/A2引物分別擴增出535 bp和285 bp的DNA條帶，系牛流產(chǎn)布魯菌與豬布魯菌核酸的混合物；其余9份樣本未擴增出任何DNA帶，PCR檢測顯現(xiàn)陰性反應(yīng)，擴增結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 S1/S2引物PCR擴增

圖3 A1/A2引物PCR擴增

2.3 布魯菌病原分離結(jié)果 取18份布魯菌核酸陽性牛乳樣本在布氏瓊脂平板上直接劃線分離病原菌，置10%二氧化碳、37℃恒溫箱中培養(yǎng)數(shù)天，未觀察到布魯菌生長。

3 討論

3.1 目前，布魯菌病的檢測技術(shù)主要是血清學方法和分子生物學方法，由于本次試驗所檢測的樣本局限于牛乳，而血清學方法中的全乳環(huán)狀試驗所需樣本受初乳、泌乳后期乳、腐敗變質(zhì)乳、患乳房炎及其他乳房疾病乳汁的影響[5-6]，另據(jù)多位學者證實，PCR技術(shù)作為檢測牛乳中的布魯菌有很好的效果[7]，故本試驗選擇了PCR方法對牛乳樣本進行檢測。

3.2 采用套式PCR方法檢測的234份接種過S2株布魯菌活疫苗的牛乳樣本，18份顯示布魯菌陽性，陽性率達到7.69%（18/234）。對檢出的核酸陽性乳樣本進行布魯菌種的鑒別，9份牛乳檢測出豬種布魯菌核酸，這可能與該奶牛場接種了S2株布魯菌活疫苗有關(guān)；1份牛乳同時檢出牛流產(chǎn)布魯菌和豬布魯菌核酸，說明該奶牛感染了牛流產(chǎn)布魯菌野菌株；其余9份牛乳樣本PCR檢測顯現(xiàn)陰性反應(yīng)，可能與布魯菌屬細菌主要分為6個種、19個生物型（牛流產(chǎn)布魯菌1、2、3、4、5、6、7型和9型；豬布魯菌1、2、3、4型和5型；羊馬爾他熱布魯菌1、2型和3型等）有關(guān)[8]。而目前采用的PCR引物并不能擴增出所有生物型的布魯菌，如：AMOSPCR所設(shè)計的引物只能擴增出1、2、4型牛流產(chǎn)布魯菌和1型豬布魯菌[9]。本次試驗也采用了AMOSPCR方法對9份豬布魯菌核酸進行鑒定，均出現(xiàn)了陽性擴增帶。

3.3 試驗采用布魯菌選擇性培養(yǎng)基對18份陽性牛乳樣本進行了病原菌分離，結(jié)果為分離出布魯菌病原菌。出現(xiàn)這一結(jié)果主要有兩種可能性：一方面可能是牛乳中為死亡的布魯菌；另一方面可能是牛乳中其他雜菌較多，大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌，甚至變形桿菌、綠膿桿菌等生長速度太快，完全掩蓋了布魯菌菌落的生長，布魯菌需要在10%二氧化碳、37℃恒溫箱中培養(yǎng)3～4 d才能出現(xiàn)肉眼可見的菌落。同時分離的樣本量較少也是其中一個因素。

3.4 牛流產(chǎn)布魯菌種的鑒定中6號牛乳樣本擴增出一條285 bp的DNA條帶，與A19株牛流產(chǎn)布魯菌陽性對照相一致；同時在圖譜上方還顯現(xiàn)一條423 bp的DNA條帶。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)查詢美國生物信息中心（NCBI）收集的布魯菌OMP2基因核苷酸序列，A1/A2引物除能夠擴增牛流產(chǎn)布魯菌形成285 bp的DNA條帶外，對某些生物型的豬布魯菌也具有相應(yīng)的核苷酸序列，預期擴增長度為423 bp。根據(jù)A1/A2引物的PCR擴增圖譜和S1/S2的核酸檢測結(jié)果，6號牛乳系牛流產(chǎn)布魯菌與豬布魯菌核酸的混合污染樣本。

[1]李鵬，羅德炎，高永輝，等.布氏桿菌BCSP31/pVAX1重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及其免疫保護效果的研究[J].中國人獸共患病學報，2006，22（6）：493-497.

[2]殷文武，孫輝.中國布魯菌病疫情形勢及對策建議[J].疾病監(jiān)測，2009，7：475-477.

[3]王麗，馬國柱.PCR技術(shù)用于布魯氏菌病的診斷研究[J].中國地方病防治雜志，2004，19（2）：65-67.

[4] 李艷，苗利光，劉艷環(huán).檢測和鑒別流產(chǎn)布魯氏菌與豬布魯氏菌的復合PCR方法的建立[J].特產(chǎn)研究，2008，3：1-3.

[5]臧鵬偉，張振嵐，范萬東，等.全乳環(huán)狀試驗檢測奶牛布氏桿菌病的試驗探討[J].中國獸醫(yī)雜志，2005，41（12）：50-51.

[6]樊兵菊，宋喜山，梁琴.全乳環(huán)狀試驗在奶牛布病檢測中的應(yīng)用[J].奶牛雜志，2006，2：31.

[7]Cortez A，Scarcelli E，Soares R M，et al.Detection of Brucella DNA from aborted bovine foetuses by polymerase chain reaction[J].AustVet J，2001，79：500-501.

[8]世界動物衛(wèi)生組織.哺乳動物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊[M].農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局譯.北京：中國農(nóng)業(yè)科學出版社，2002：308-310.

[9]鐘旗，范偉興，何倩倪，等.用AMOS-PCR對布魯氏桿菌種型鑒定的研究[C].北京：全國人畜共患病學術(shù)研討會論文集，衛(wèi)生部、農(nóng)業(yè)部、中國科學技術(shù)協(xié)會，2006：262-265.