熒光光譜法在半抗原-載體蛋白偶聯物鑒定中的應用

張麗芳，李偉嶺，江兆玲，王 米，鄭文麗，薛飛群

（中國農業科學院上海獸醫研究所中國農業科學院獸藥安全評價與獸藥殘留研究重點開放實驗室農業部寄生蟲病學重點開放實驗室，上海 閔行區200241）

食品安全是目前全球最關注的一大熱點，農藥和獸藥的不合理使用甚至濫用導致食用農產品殘留超標，已成為食品安全的突出問題之一，開發可靠、靈敏、快速和實用的快速分析檢測技術無疑是監測和控制殘留、保障人民身體健康和避免國際間貿易爭端的重要前提。而免疫分析技術特別是酶聯免疫吸附分析技術作為一項快速檢測技術，以其抗原抗體反應的高專屬性，測定方法簡單、快速、靈敏度高、費用低和適于現場大批量樣品篩選等優點，在農藥獸藥殘留分析和環境檢測中展示了廣泛的應用前景[1-4]。

免疫分析法是利用抗原和抗體的結合反應的檢測方法，而大多數農藥和獸藥都是小分子物質（也叫半抗原），相對分子質量在1 000 Da以下，它缺乏T細胞表位而無法直接誘導動物機體產生特異性的抗體，但把它以共價鍵方式偶聯到大分子蛋白載體上制備成人工抗原(也稱偶聯物)后，可借助其T細胞來間接誘導B細胞的增殖與分化，產生特異性的抗體，這也是小分子免疫分析的基本模式。在這項技術中，鑒定人工抗原（半抗原-載體蛋白偶聯物）是否偶聯成功是建立免疫分析方法的前提和關鍵所在。目前半抗原-載體蛋白偶聯物的鑒定方法主要有紫外分光光度法[5]、紅外分光光度法[6]、電泳法[7-9]和基質輔助激光解吸飛行時間質譜法[10-11]等等，到目前為止還沒見熒光光譜法應用于半抗原-載體蛋白偶聯物的鑒定中的文獻報道。

目前熒光光譜法主要應用于小分子與蛋白或其他生物大分子以非共價鍵相互作用方面的研究，而人工抗原是小分子半抗原與載體蛋白以共價鍵結合得到的偶聯物。本文以苯甲酸和苯胺為小分子半抗原分別與載體蛋白牛血清白蛋白進行偶聯，開展半抗原-載體蛋白偶聯物的熒光光譜鑒定的初步研究，試圖建立一種新的半抗原-載體蛋白偶聯物鑒定的新方法。

1 儀器與試劑

熒光分光光度計（F-2500，日本日立公司）。所有試劑均為分析純試劑（市售）。

2 半抗原－載體蛋白偶聯物的制備

2.1 苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯物的制備 稱取0.12 g（1mmol/L）苯甲酸，加3mL 1，4-二氧六環，于4℃下加入0.14 g（1mmol/L）三丁胺和00.14 g(1 mmol/L)氯甲酸異丁酯攪拌30min，此為甲液。

稱取0.66 g（0.01mmoL）牛血清白蛋白（BSA）加50%二氧六環水溶液，此為乙液。將甲液滴加入乙液，4℃下攪拌過夜。將反應液轉移入透析袋，用磷酸pH緩沖液（pH值7.4）透析3 d，每天換液2次。取透析袋中絮狀物，真空冷凍干燥即得白色固體。

2.2 苯胺-牛血清白蛋白偶聯物的制備 稱取0.09 g（1mmol/L）苯胺，加3mL 1mol/L鹽酸，冰浴下攪拌滴加入1%NaNO2水溶液至淀粉碘化鉀試紙變藍，此為甲液。

稱取0.66 g（0.01mmol/L）牛血清白蛋白（BSA）加15mL碳酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH值9.6）水溶液溶解，此為乙液。于4℃下將甲液滴加入乙液，4℃下攪拌過夜。將反應液轉移入透析袋，用磷酸pH緩沖液（pH值7.4）透析3 d，每天換液2次。取透析袋中絮狀物，真空冷凍干燥即得棕色固體。

3 熒光光譜測定

分別取牛血清白蛋白、苯胺、苯甲酸、苯胺-牛血清白蛋白偶聯物和苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯物適量加50%甲醇水溶液溶解成各試液，取各試液分別置于1 cm石英比色液池中，設置空白溶劑為50%甲醇水溶液，激發波長為278 nm,激發和發射單色儀的狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為300 nm/min，掃描范圍320～500 nm等條件進行熒光發射光譜掃描測定。

4 結果與討論

4.1 激發波長的確定 牛血清白蛋白因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等具有熒光特性的氨基酸而顯示有熒光特征，苯甲酸和苯胺并不具有熒光特征，因此本文首先通過固定激發波長來掃描牛血清白蛋白的發射光譜和固定發射波長掃描牛血清白蛋白的激發光譜，摸索最佳的激發波長，結果發現在激發波長278 nm下，牛血清白蛋白的熒光發射強度最強，為苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯物和苯胺-牛血清白蛋白偶聯物的鑒定奠定基礎。

4.2 熒光光譜分析 圖1是牛血清白蛋白和苯胺-牛血清白蛋白偶聯物的熒光光譜圖。從圖1中可看出，苯胺-牛血清白蛋白偶聯物的最大發射波長在350 nm，與牛血清白蛋白、苯胺及其兩者的混合物相比發生了明顯的位移，表明苯胺已被成功偶聯到牛血清白蛋白上了。

圖1牛血清白蛋白及其苯胺-牛血清白蛋白偶聯物的熒光光譜

圖2是牛血清白蛋白和苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯物的熒光光譜圖。從圖2中可看出，苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯物的最大發射波長在320 nm處，其熒光發射圖譜與BSA及BSA與苯甲酸混合物的熒光光譜略有區別，因此也能斷定，苯甲酸已與牛血清白蛋白成功偶聯。

圖2牛血清白蛋白及其苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯物的熒光光譜

在人工抗原的制備中，小分子以特定的基團（如氨基-NH2、羧基-COOH等等）通過相應的反應連接到載體蛋白上。本研究中，苯胺通過氨基的重氮化法與牛血清白蛋白上的色氨基酸、酪氨基酸殘基等偶聯。由于牛血清白蛋白產生熒光主要也是這些氨基酸貢獻的，一旦有其他基團連接上后，就改變了原來的熒光光譜特性。因此苯胺-牛血清白蛋白偶聯物的熒光光譜與其載體蛋白牛血清白蛋白的熒光光譜區別很大；而苯甲酸是通過其羧基以混合酸酐法與牛血清白蛋白上的伯氨基形成酰胺鍵而偶聯，因此其偶聯物的熒光光譜與其載體牛血清白蛋白的相比變化不大，只是在熒光發射強度上有一定的區別。

5 結論

經過熒光光譜法鑒定結果初步表明，苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯物和苯胺-牛血清白蛋白偶聯物合成成功。熒光光譜法簡單、快速且靈敏，可望成為小分子-載體蛋白偶聯物鑒定的有效方法。

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