犬細小病毒山東流行株分離鑒定及其全基因組測序分析

于永樂，宮文妮，楊海燕，趙秀美，張傳美，張洪亮，單 虎

（1.青島農業大學山東省預防獸醫學重點實驗室，山東 青島266109；2.無錫出入境檢驗檢疫局，江蘇 無錫214101；3.南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京210095）

犬細小病毒（canine parvovirus，CPV）自1978年發現以來，已在全世界多個國家迅速傳播和蔓延，是目前公認的引起犬及犬科動物出血性腸炎和心肌炎的重大病原之一。在我國，1982年最早報道了此病的發生，此后的30多年伴隨著該病毒的不斷進化和變異，給我國養犬業帶來越來越大的損失[1]。

CPV是單股、負鏈、線性DNA病毒，基因組全長5.2 kb，包含兩個大開放閱讀框ORF1(編碼結構蛋白VP1和VP2)和ORF2(編碼非結構蛋白NS1和NS2)[2-3]，其中VP2蛋白是主要的衣殼蛋白和病毒保護性抗原蛋白，同時具有自我裝配形成病毒樣顆粒（VLPS）的能力[4]。NS1蛋白是主要的非結構蛋白，也是一個多功能的基因表達調控蛋白，而且目前研究證實NS1蛋白與CPV致細胞凋亡有關[5]。犬細小病毒最顯著的生物學特性就是其VP2基因高的進化速率（2×10-4次/位點·年），已達到某些RNA病毒的進化速率[6-7]。這主要表現在新的抗原變異體的不斷出現，從1979-2000年，CPV-2發生了幾次重要的基因變異，先后產生了CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a和New CPV-2b、CPV-2c(a)和CPV-2c(b)以及CPV-2c七種抗原變異株[8-9]，每一種抗原變異株的出現都對犬細小病毒進化機制的深入研究產生了深遠的影響。本研究通過對山東地區犬細小病毒流行株分離鑒定和全基因組分析，從而確定分離株的來源和遺傳變異情況，為山東地區犬細小病毒的遺傳進化、流行病學等進一步的研究奠定基礎，為疫苗的研制提供新的材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 病毒分離樣品來自山東各地區寵物醫院發病犬，CPV膠體金抗原檢測試紙條檢測為CPV陽性，采集糞便，用于病毒分離培養。F81細胞由青島農業大學山東省預防獸醫學重點實驗室保存。犬細小病毒參考毒株為犬細小病毒滅活疫苗，購自Intervet公司。

主要試劑有DMEM培養基、胎牛血清，購自美國Gibco公司；DNAiso Reagent、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000、pMD 18-TVector、膠回收試劑盒、大腸桿菌DH-5α感受態細胞，均購自寶生物工程(大連)有限公司；其余所使用試劑均為分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖與分離 取患病犬的糞便，按1∶9的比例加入滅菌的PBS，研磨離心取上清液，按1∶9的比例加入氯仿，混勻離心取上部水層加入青霉素和鏈霉素，濾膜過濾除菌，-70℃保存備用。采取同步接毒法，每10mL細胞營養液中加入病料上清500μL，試驗過程中設對照。培養接毒細胞和對照細胞，觀察有無病變產生。待80%細胞產生細胞病變（CPE）時，收獲病毒。

1.2.2 引物設計與合成 根據GenBank登錄的犬細小病毒VP2基因序列，利用軟件設計了一對特異性檢測引物，預期擴增片段大小為685 bp；P1：5'-GAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGG-3'；P2：5'-AACCAAAGTTAGTACCTCCTTCAGC-3'。全基因引物參考郭偉等[12]設計的6對引物進行全基因的擴增，引物均由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

1.2.3 病毒DNA提取 取500μL F81細胞培養的病毒液，按照DNAiso Reagent說明書方法提取DNA，用30μL滅菌超純水溶解后儲存于-20℃備用。

1.2.4 病毒鑒定和全基因組克隆

1.2.4.1 病毒PCR鑒定 反應體系為25μL：模板DNA 3μL，10 X PCR Buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，P1 0.5μL，P2 0.5μL，Taq酶0.5μL，ddH20 16μL。95℃預變性5min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸lmin，共30個循環；最后72℃延伸10min。反應結束后進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4.2 病毒電鏡形態學觀察 將盲傳至第4代的病毒液，8 000 r/min離心10min后，取上清液，將上清液病毒濃縮后，0.5%磷鎢酸負染，電鏡下放大60 000倍，觀察病毒粒子形態。

1.2.4.3 病毒全基因組克隆 按照郭偉等[10]建立的PCR程序進行擴增，回收各個目的片段，將其連接到pMD l8-T載體上，轉化至DH-5α感受態細胞中，涂布于氨芐青霉素瓊脂平板，37℃過夜培養。挑取單個菌落擴大培養，經PCR鑒定后送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.5 全基因組序列比較與分析 將所分離到細小病毒株各個基因片段用DNAStar軟件進行序列拼接，得到的全基因序列與GenBank參考毒株進行比對分析。對所獲得的各VP2基因序列的核苷酸序列及推導的氨基酸序列進行比對分析。

2 結果

2.1 病毒的分離培養及PCR鑒定 20份病料同步接種到正常生長的F81細胞，盲傳至第3代72 h，有4份出現明顯的變形、聚堆、拉網結絲等細胞病變，繼續帶毒盲傳至第5代均能出現典型細胞病變，而對照組細胞未出現任何病變。以F5代病毒液DNA做模板，應用設計的特異性引物從疫苗株和分離毒株中均擴增出685 bp的目的片段，與理論設計值大小相符(圖1)。結果證實分離到了4株CPV，分別命名QN1/QN2/QN3/QN4。

2.2 電鏡觀察結果 將第5代F81細胞培養物經磷鎢酸負染后進行電鏡形態學觀察，發現呈立體對稱的，直徑約20～25 nm的空心病毒粒子（圖2）。

圖1 病毒分離PCR結果

圖2 電鏡負染后的病毒粒子

2.3 CPV分離株全基因組克隆與序列分析 除QN3株序列總長為4 756 bp，其余3株為4 757 bp，其中5，UTR長153 bp，3，UTR長335 bp，ORF1全長2 007 bp，編碼非結構蛋白基因NS1、NS2；ORF2全長2 255 bp，編碼結構蛋白基因VP1、VP2；四株CPV之間全序列核苷酸同源性為99.31%，與國際參考毒株（CPV-N）的同源性分別為：98.9%、98.9%、99.0%和99.4%；與GenBank登錄的10株具有代表性的CPV核苷酸序列比對，同源性為98.2%～99.9%，其中，四株CPV與6株國內參考毒株的同源性比4株國外參考毒株的同源性高，說明本分離株與國內分離毒株可能具有相同的起源。此外，本研究發現分離株在3，UTR有堿基插入和缺失存在，與CPV-N相比：QN1、QN2和QN3株在4 574～4 636、4 702～4 763和4 844～4 905位點以及QN4株在4 574～4 616和4 700～4 824位點有堿基缺失；與CPV-Y1相比：QN4株在4 844～4 905位點有堿基插入。

2.4 CPV分離株全基因系統進化分析 全基因系統進化樹分析如圖3所示，QN1、QN2和QN3株與廣西分離株CPV-2a處于同一分支，親緣關系較近；QN4株與甘肅分離株CPV LZ1處于同一分支，親緣關系較近，與CPV Laika-1993株進化關系最遠，其親源關系較為疏遠?？傮w而言，4株CPV與國內其他幾株分離毒親緣關系較近，尤其是與國內近期分離毒株間高度同源，同屬一個亞型，而與CPV-N等國外毒株親緣關系較遠，說明所分離毒株可能由國內流行毒株進化而來。

圖3 CPV分離株全基因組系統進化樹

2.5 CPV分離株VP2基因與國內外分離株的核苷酸序列及推導氨基酸序列同源性比較 將4個CPV分離株與17個國內外分離株進行VP2基因的核苷酸序列及推導氨基酸序列同源性比較。結果表明，不同地域CPV分離株VP2基因序列同源性高，變異小，核苷酸同源性為98.5%～99.9%，推導的氨基酸同源性為97.4%～100.0%，但各分離株與疫苗株的同源性較低，差異大。與原始CPV-2a亞型相比，其VP2基因297位氨基酸發生了S到A替換，依此判定4個CPV分離株同屬New CPV-2a亞型。

3 討論

本實驗室從送檢的疑似犬細小病毒感染的發病犬糞便中分離出4株細小病毒，根據流行病學、實驗室檢測證實該分離株為CPV。為分析毒株的遺傳演化，對分離株進行了全基因測序，結果表明，除QN3株的基因組全長為4 756 nt外，其余3株均為4 757 nt，4個分離株之間同源性為99.31%，與國際參考毒株（CPV-N）的同源性分別為：98.9%、98.9%、99.0%和99.4%；與GenBank登錄的10株具有代表性的CPV全基因組核苷酸序列比對，同源性為98.2%～99.9%，說明國內外分離株基因序列差異不大，但從系統進化樹分析上分析，4個分離株與國內毒株親緣關系更近，處于同一大的分支上，說明山東地區犬細小病毒并沒有形成獨立的分支。此外，本研究發現分離株在3，UTR有插入和缺失位點存在，3，UTR是CPV mRNA翻澤的起始端，其序列的改變會影響病毒翻澤，從而可能影響病毒對細胞的感染能力[11-12]。

由于VP2基因序列涵蓋了CPV所有的中和抗原表位，VP2若干個堿基及氨基酸的非同義置換則會改變病毒的宿主范圍及抗原特性，所以對VP2基因的比較和分型具有非常重要的生物學意義[13]。結果表明，本試驗克隆和測定的4株CPV結構蛋白編碼的VP2全基因其核苷酸1 755 bp，編碼氨基酸585個。與17個國內外分離株核苷酸同源性為98.5%～99.9%，推導的氨基酸同源性為97.4%～100.0%，說明VP2基因變異相對較少。氨基酸序列分析可知，與原始CPV-2a亞型相比，分離株297位氨基酸還發生了S到A替換，說明本次分離株同屬于New CPV-2a亞型，這與王凈等[14]分析一致，認為目前New CPV-2a亞型在中國占主導地位。由于321位點和324位點位于衣殼蛋白GH環，而該環上的氨基酸大部分處在病毒粒子的外表面，因此，這兩處位點N到D、I到Y的替換可能會引起蛋白三維結構的改變，從而影響到CPV的宿主范圍。此外，QN1第497位氨基酸Q到L的替換、QN2第2位氨基酸S到G的替換和QN4第151位氨基酸K到R的替換都未見報道，這可能與病毒的進化和致病性有關，有待了解這些部位氨基酸突變的確切生物學意義。

犬細小病毒從出現到目前雖僅有30多年的歷史，但該病毒進化速度快，血清型也不斷出現新的變異，該病毒引起的疾病仍然沒有得到有效的控制。目前普遍使用的商品化疫苗株為CPV-2亞型，而國內主要的流行毒株為New CPV-2a亞型，這種流行毒株與疫苗毒株的差異可能是造成疫苗免疫失敗原因之一。本研究通過分離近期流行毒株并進行一系列鑒定和分析，為有針對性地開發特異、高效的犬細小病疫苗奠定了基礎。

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