血小板膜蛋白受體信號轉導通路的研究進展

陸 四(綜述)，孟照輝(審校)

(昆明醫科大學第一附屬醫院心內科 分子心血管病研究室，昆明 650032)

當血管受損內皮下膠原暴露時，首先血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)介導糖蛋白(gluco protein，GP)Ⅰb-Ⅴ-Ⅸ與膠原結合，產生黏附，導致快速流動的血小板減速，使GPⅥ易與膠原結合，同時，血小板內容物釋放，進一步介導血小板釋放、聚集，并使已黏附和聚集的血小板趨于穩定，這個過程是由血小板膜受體經一系列信號轉導來實現的[1]。血小板信號轉導分為三個過程:①血小板激活劑與血小板膜受體結合，介導早期信號轉導；②各信號路徑相互協調，最后形成一條由內向外的共同信號通路激活GPⅡb/Ⅲa受體；③GPⅡb/Ⅲa受體激活后介導由外向內的信號通路[2]。目前發現的血小板信號通路主要有：磷脂酶C-β(phospholipase C-β，PLC-β)途徑、酪氨酸蛋白激酶途徑、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)途徑、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)途徑、腺苷環磷酸-蛋白激酶A途徑、磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)花生四烯酸路徑[3]。這些受體及其信號路徑也是研究抗血小板藥物的作用靶點，該文主要對血小板信號轉導途徑及抗血小板藥物研究予以綜述。

1 血小板膜受體分類

血小板膜蛋白受體分整合素和非整合素兩類。整合素類有：GPⅠa/Ⅱa、纖維蛋白GPⅠc/Ⅱa、層粘連蛋白GPⅠc/Ⅱa、GPⅡb/Ⅲa、玻璃結合蛋白GPⅤnR。非整合素類有：GPⅠb/Ⅱa、GPⅣ、GPⅥ及凝血酶、血栓素A2(thromboxane A2,TXA2)、腎上腺素、蛋白酶激活受體(protease activated receptors，PAR)、加壓素和前列環素2、ADP等受體，且大部分屬G蛋白偶聯受體[4-5]。

2 血小板膜受體及其信號轉導途徑

2.1vWF受體 包括GPⅠb-Ⅴ-Ⅸ、GPⅡb/Ⅲa兩種。GPⅠb-Ⅴ-Ⅸ由GPⅠbα、GPⅠbβ、GPⅨ和GPⅤ四個亞基組成，通過非共價鍵以2∶4∶1∶2的比例組成，由于GPⅤ功能尚不明確，因此通常稱之為GPⅠb-Ⅸ復合物。免疫球蛋白Fc受體中的γ鏈的跨膜區與該受體組成受體復合物，γ鏈中含有免疫受體酪氨酸激活酶基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)，是該受體信號轉導部分，當血管受損內皮下膠原暴露時，血漿vWF的A3區與膠原結合，導致vWF構型變化，其A1結構域與GPⅠbα的N端結合[6-7]，使快速流動的血小板減速，并在vWF表面滾動形成不穩定血栓，隨后被膠原與其受體更穩定的結合而取代[8]。結合后的受體結構也產生變化，ITAM系列中的酪氨酸被Src家族酪氨酸激酶(the Src family of complex amino acid kinase,SFKs)磷酸化(Src家族中以Lyn蛋白酶磷酸化為主)，導致酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)激活，使下游蛋白酶如活性T細胞連接蛋白(active T cells connected protein,LAT)酶和相對分子質量為76×103的含有2個酪氨酸(spleen tyrosine)同源受體結構域的白細胞磷酸蛋白酶(leukocyte phosphoric acid protease-76)即SLP-76酶磷酸化，催化產生LAT、SLP-76、酪氨酸激酶(Bruton′s tyrosine kinase，Btk)、生長因子結合蛋白2相關銜接蛋白(growth factor binding protein-2 related proteins，Gads)及PLCγ，這些蛋白酶與PLCγ形成復合物。其信號路徑為GPⅠb-Ⅴ-Ⅸ→SFKs(以Lyn蛋白酶磷酸化為主)→Syk→LAT/SLP-76/Btk-Gads→PLCγ，PLCγ催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸生成三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)和二酰甘油(diacylglycerol，DAG)，兩者在Ca2+的參與下分別激活下游蛋白，即PLCγ→IP3+Ca2+→Cal-DAG-GEF1(calcium and DAG-regulated GEF1)→ras基因相關蛋白1b(repressor activator protein 1，Rap1)→MAPKs→PLA2和PLCγ→DAG→Cal-DAG-GEF1→Rap1→RIAM(Rap1-GTP interacing adaptor molecule)→talin/kindlin；PLCγ還可激活PI3K，使PLCγ招募更多活化蛋白而加強PLCγ活性；DAG還介導DAG→蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)→RIAM→talin/kindlin參與共同信號途徑[2]。激活的SFKs也可激活PI3K，PI3K激活蛋白激酶(protein kinase,PK)Bα、PKBβ、PKBγ或AKT1、AKT2、AKT3，使內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOs)激活，eNOs激活可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylyl cyclase,sGC)，催化鳥苷酸為環一磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)，激活下游蛋白PLA2；其信號途徑為GPⅠb-Ⅴ-Ⅸ→SFKs(Lyn)→PI3K→PKB→eNOS→sGC→cGMP→PKG→MAPKs→PLA2，介導血小板形態變化、TXA2合成、ADP等內容物釋放。MAPKs是否參與信號共同路徑還待研究[2]。

2.2膠原受體GPⅥ及信號轉導途徑 GPⅥ屬免疫球蛋白家族，ITAM是其信號轉導部分；近跨膜區富含堿性氨基酸的區域，能與鈣調蛋白結合，位于中部的富含脯氨酸基序，可選擇性與(SFKs)(主要是Fyn和Lyn)SH3區結合，使ITAM系列Y XXL/I-X6-8 XXL/LI被Lyn和Fyn磷酸化，該系列基本組成是：I(異亮)/V(纈)XY(酪)XXL(亮)，該系列磷酸化后導致Syk激活,后者作用與vWF受體相同，其信號路徑為GPVI→SFK(以Lyn)→Syk→PI3K→PKB→eNOS→sGC→PKG→MAPKs→PLA2和GPⅥ→SFK(Lyn)→Syk→LAT/SLP-76/Btk-Gads/PLCγ，PLCγ酶解磷脂酰肌醇二磷酸生成DAG和IP3，兩者作用與vWF受體中的DAG和IP3相同，導致TXA2合成，內容物釋放及激活α2bβ3受體[1-2,9]。

2.3GPⅠa/Ⅱa受體及信號傳遞途徑 該受體由α2和αβ1兩亞基組成，α2與vWF因子的膠原結合區域有同源性，β1亞基有一富含四個半胱氨酸的區域及一個與其他整合素β亞基相似的結構。α2與內皮下Ⅰ型和Ⅳ型膠原直接結合，其結合依賴于Mg2+，而被Ca2+抑制；αβ1起信號轉導作用，其信號路徑有：GPⅡa→SFK(Lyn)→Syk→LAT/SLP-76/Btk-Gads→PLCγ，PLCγ作用與vWF受體的PLCγ相同，使血小板活化，釋放內容物，也參與共同信號路徑激活α2bβ3受體。GPⅠa/Ⅱa在血小板與膠原黏附、活化中起關鍵作用，缺乏則血小板出現黏著力減弱及對膠原誘導的血小板缺乏聚集反應[1-2,10]。

2.4GPⅠb-Ⅴ-Ⅸ與GPⅥ的關系 GPⅠb-Ⅴ-Ⅸ與膠原結合需vWF介導，后者直接與膠原結合。Arthur等[8]報道，低切應力狀態下，GPⅥ啟動血小板聚集，而GPⅠb-Ⅴ-Ⅸ則引發高切應力下的血小板聚集。但Arthur等[8]研究發現，應用鼠源抗人血小板膜糖蛋白GPⅠbα單克隆抗體，可明顯阻斷GPⅥ特異性誘聚劑C反應蛋白誘導的血小板聚集，并證實兩者血小板表面均存在相互作用。

2.5GPⅠa/Ⅱa與GPⅥ的關系 Mazzucato等[11]、Miura等[12]和Kato等[13]發現，缺乏FcRγ鏈或GPⅥ基因剔除的小鼠或加入自身抗體的血小板對膠原刺激無反應，但無明顯出血傾向。Jung等[14]和Siljander等[15]認為，GPⅥ介導與膠原最初結合，導致α2β1和α2bβ3活化，后者介導膠原的穩定結合并加強GPⅥ的信號轉導。Arthur等[8]報道，GPⅥ與膠原初期黏附介導的信號能提高α2β1與膠原結合的親合力，抑制GPⅥ可顯著抑制膠原誘導的血小板黏附、聚集。Sarratt等[16]則認為兩者在血小板與膠原結合中發揮同等重要作用，它們通過各自的信號路徑激活血小板，且兩者相互協調。

2.6嘌呤受體 該受體有P2Y1、P2Y12和P2X1三種。前兩種是ADP受體，為G蛋白偶聯受體，兩者任何一種受體缺陷都導致血小板不能活化；后一種為ATP受體，是配體門控離子通道。ADP不能使洗凈血小板聚集，若加入纖維蛋白原，則可引起血小板聚集，說明ADP主要通過信號傳遞引起內源性纖維蛋白原釋放而發揮作用[15,17-18]。

2.6.1P2Y12受體 該受體與G蛋白α亞基的i類蛋白，即Gαi偶聯，激活后啟動兩條信號轉導途徑。①由G蛋白α亞基的s類蛋白，即Gαs介導的抑制腺苷酸環化酶(AC)使環一磷酸腺苷減少；②由Gαi介導，即Gαi-SFK(Lyn)→Syk→PI3K→AKT→eNOS→sGC→PKG。PKG使血小板釋放，也激活MAPKs而致PLA2激活，使TXA2合成；PI3K和Src也可催化PKB(又稱AKT或Rac)、ERK(extracellular signal regulated kinase)、Rap1b等酶磷酸化。其中Rap1b參與Rap→MAPKs→PLA2和Rap1→RIAM→talin/kindlin途徑。P2Y12主要介導延遲而持續的Rap1激活，既能直接激活GPⅡb/Ⅲa受體，也介導TXA2合成，加強TXA2及低劑量凝血酶受體信號途徑，對Cal-DAG-GEF1介導的快速、可逆Rap1信號路徑起補充作用[2,17,19]。

2.6.2受體P2Y1 其與Gαq相偶聯，有兩條信號途徑。①Gq→SFK(Lyn)→Syk→PI3K→AKT→eNOS→sGC→PKG。PKG、PI3K與P2Y12的作用相同。②Gq→SFK(cSrc)→PI3K→LAT/SLP-76/Btk-Gads→PLCβ。PLCβ與vWF受體的PLCγ相同。此途徑是ADP受體誘導血小板變形的主要途徑，若Gq缺乏，血小板對ADP、TXA2、凝血酶甚至膠原受體介導的血小板釋放、聚集均明顯降低。Gq幾乎是所有血小板G蛋白偶聯受體激動劑所必需的，但它不能使ADP受體介導的血小板充分聚集，且在TXA2和低劑量凝血酶介導血小板活化中也不是最佳的，只是使α2bβ3依賴性血小板短暫、不完全聚集；其形成的Cal-DAG-GEFI也可對P2Y12受體信號途徑中的Rap1b、AKT等蛋白酶信號起補充作用[2,17,19-20]。

2.7PAR 人體PAR有PAR1、PAR4，與Gq、G13偶聯。PAR1被凝血酶在R41和S42之間裂解后，暴露出一條新肽鏈，后者為配體再與自身一段肽鏈結合，使受體激活，激活的G13活化鳥苷酸結合因子(guaninenucleotide exchanging factors，GEFs)如p115RhoGEF，使小G蛋白RhoA變為GTP-RhoA活化形式，激活Rho激酶，Rho激酶磷酸化肌球蛋白輕鏈并抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶，加強依賴肌球蛋白輕鏈的相關收縮，導致血小形狀改變及釋放反應，之后GTP-RhoA轉變為RhoA-GDP而失活；G13缺損的血小板黏附力、釋放及血栓形成均缺陷。Gq途徑產生信號路徑與P1Y2的Gq路徑相同,但產生的PKC以PKCδ/θ為主。PAR是否與Gi偶聯尚不確定。在血小板聚集過程中，若用腺苷阻斷內源性ADP釋放或用腺苷三磷酸雙磷酸酶破壞ADP，則凝血酶不能使血小板聚集，說明凝血酶的作用可能是與受體結合后，引起內源ADP釋放而引起血小板聚集[2,15,20]。

2.8由內向外的共同信號通路 各受體激活后，通過ITAM、Gq和Gi途徑分別產生PLCγ/β，使磷脂酰肌醇4,5-二磷酸水解為IP3和DAG,通過IP3/DAG→IP3R→Ca2+→Cal-DAG-GEF1→Rap1→RIAM→talin/kindlin途徑及DAG→PKC→RIAM→talin/kindlin途徑激活α2bβ3受體。信號中的Cal-DAG-GEF1通過改變Rap1使許多Ras家族蛋白酶激活，再作用于RIAM使talin或kindlin激活。Li等[2]和Moser等[21]報道，激活α2bβ3需talin和kindlin蛋白參與，kindlins與α2bβ3受體C端NXXY區結合，調控talin與α2bβ3連接，并與talin一起作用于α2bβ3，從而實現信號由內向外轉導；Talin蛋白與β3的NPLY區結合，使α2b和β3結構發生變化，導致受體胞外區結構變化。但Cal-DAG-GEF1只起輔助作用,其缺乏時，依賴α2bβ3受體聚集的血小板僅有部分缺失，表明還存在其他信號途徑，如DAG→PKC途徑及ADP受體P2Y12通過Gai信號路徑中的蛋白酶如PKB、PI3K等均可直接激活Rap1而介導GPⅡb/Ⅲa受體激活，后者既與Fg結合成為“橋鏈”使相鄰血小板聚集形成血栓，也介導由外向內的信號傳遞，起信號放大作用[22]。

2.9由外向內的信號通路─纖維蛋白原受體 GPⅡb/Ⅲa激活后與纖維蛋白原、vWF結合，形成新配體誘導結合點[22]，并觸發2條由外向內的信號。①經G13/GPCRs路徑介導RhA激活，其路徑與凝血酶的相同；②G13與α2bβ3的β3連接激活SFKs，SFKs介導由外向內的信號機制有:①SFKs介導β3胞質區NXXY樣結構磷酸化，在其Y759位磷酸化促進β3與鈣蛋白連接，在Y474位磷酸化則干擾Talin蛋白的連接。β3酪氨酸的磷酸化可使β3激活胞內信號分子，如肌球蛋白重鏈、銜接蛋白SHC、Src及Syk。②Src磷酸化后，使小G蛋白RhoA-GTP磷酸酶激活，使RhoA變為RhoA-GDP而被短暫抑制，介導血小板早期在纖維蛋白原上鋪展；之后，β3被鈣蛋白酶水解，Src與β3的相互作用即消失，使Src對RhoA的抑制作用解除，使RhoA被激活，導致血栓收縮反應。③SFKs通過激活Syk，Syk與Src一起使FcγRⅡA磷酸化，Syk也通過與β3胞質區相互作用，促進SLP-76/LAT/Btk/Vav復合物活化并與PLCγ2聚集，其作用與GPVI介導ITAM信號途徑相似。這兩條路徑互相協調以調節Rho的活性，調控血小板形態改變、內容物釋放、血凝塊收縮等反應[2,19-20,22]。

由上述信號轉導途徑可知，干擾或阻斷血小板活化過程的每一條信號路徑，都能對血小板活化起抑制作用，這是臨床研究抗血小板藥物的理論基礎。

3 抗血小板藥物

目前臨床上應用的三類抗血小板藥物有：①環氧化酶抑制劑，如阿司匹林；②ADP受體拮抗劑，如氯吡格雷；③GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑，如替羅非班。這三類抗血小板藥物顯著降低了心血管疾病患者的發病率及病死率，但它們均存在一定不良反應，如10%～20%患者5年內仍可復發血栓性事件，5%～60%的患者有藥物抵抗現象，還有出血、過敏、哮喘加重等不良反應[23-26]；而15%～30%患者對氯吡格雷抵抗,且該類藥可引起貧血、出血及纖維蛋白原降低等不良反應[24-25]；GPⅡb/Ⅲa藥物治療窗狹窄，具有出血、血小板減少等并發癥[4,26-27]。

鑒于上述藥物不良反應及抵抗現象，新型抗血小板藥物的研究成為必要。

4 新型抗血小板藥物

4.1GPⅠb與vWF因子拮抗劑 6B4-Fab是識別GPⅠb受體α鏈的單克隆抗體，在狒狒股動脈狹窄模型實驗中證明其能明顯控制循環血量下降，抑制血小板在Ⅰ型膠原上沉積，而無出血時間延長。還有基因工程產生的人源化的抗vWF-A1嵌合Fab抗體，即AJW200和82D6A3，AJW200是人源化的抗vWF-A1嵌合Fab抗體，可阻斷vWF與GPⅠ結合，抑制高剪切力誘導的血小板黏附、聚集及凝血酶的產生，而不影響其他部位血流及出血時間；82D6A3是抗vWF-A3區單抗，能阻斷A3與膠原結合，抑制血小板黏附和聚集。兩者也是較理想的新型抗血小板藥物靶標[28-29]。

4.2GPⅥ拮抗劑 GPⅥ是血小板活化的主要膠原受體，在血小板黏附及GPⅡb/Ⅲa受體激活中有重要作用，GPⅥ缺乏的小鼠血小板黏附及血小板血栓形成減弱，但生理性止血功能正常。其抗小鼠GPⅥ單克隆抗體JAQ1能使GPⅥ受體下調，具有很強的抗栓作用，僅有輕微的出血時間延長，提示其可作為抗血小板研制的一個理想靶點[29-30]。

4.3新開發的ADP受體拮抗劑 包括噻吩并吡啶P2Y12拮抗劑普拉格雷及非噻吩并吡啶P2Y12受體拮抗劑坎格雷洛(cangrelor)和ticagrelor(AZD6140)。普拉格雷與其他不可逆的噻吩并吡啶P2Y12拮抗劑的不同點是在活性巰基附近有一酯團，其中一個氯原子被氟原子代替。Montalescot等[23]試驗顯示，與氯吡格雷相比，普拉格雷的心源性死亡、心肌梗死或腦卒中發生率更低，藥物抵抗者更少，但其出血風險高于氯吡格雷組。TRITON-TIMI38(trial to assess improvement in therapeutic outcomes by optimizing platelet inhibition with prasugrel)，一項隨機、雙盲、雙模擬、平行對照，以比較冠狀動脈介入治療后普拉格雷與氯吡格雷作用效果的試驗，該試驗分析研究顯示，急性冠狀動脈綜合征支架手術患者應用普拉格雷，支架血栓發生率降低52%。目前該藥已獲得FDA審批，是最有希望代替氯吡格雷的新型口服抗血小板藥物。坎格雷洛(cangrelor)是一種作用快、可逆的抗血小板靜脈制劑，無需代謝成治療活性物。Flierl等[31]研究顯示急性心肌梗死溶栓治療中輔助應用坎格雷洛是安全有效的。而ticagrelor (AZD6140)則是起效快可逆的ADP受體拮抗劑，也無需代謝成治療活性物，但該藥體內代謝后轉變為腺苷，會使部分患者出現輕度呼吸困難和心動過緩[23,27,31]。

4.4PAR拮抗劑 PAR拮抗劑有喜巴辛衍生物SCH530348(Atopaxar)和E5555(Vorapaxar)兩種，口服生物利用度較好，Jennings等[26]公布了Ⅱ期、隨機、雙盲、安慰劑對照試驗，對1030例經冠狀動脈介入術或冠狀動脈旁路移植術患者隨機分組，在接受標準冠心病二級預防基礎上，加用SCH530348(Atopaxar)組的不良事件發生率更低而不增加出血風險，其目前處于臨床Ⅲ期研究。E5555(Vorapaxar)拮抗劑體外實驗證實其能抑制凝血酶誘導的血小板聚集，抑制血管內膜及平滑肌細胞增生，而無出血時間延長，有可能成為未來急性冠狀動脈綜合征的重要藥物，目前處于臨床Ⅱ期研究中[26,32]。

4.5一氧化氮供體 一氧化氮(NO)能提高sGC活性，使cGMP水平升高，增加血流量，抑制血小板聚集，使聚集的血小板解聚等作用。給予NO底物L-精氨酸和其供體如硝酸酯類均可減輕組織器官缺血和再灌注損傷，抑制血小板黏附和聚集，并與溶栓藥物有協調作用而改善預后。有研究將NO供體基團通過酯鍵連接在阿司匹林母體上合成出一種新型的、體內緩慢釋放NO的一氧化氮阿司匹林(NO-Aspirin)，如2-(乙酰氧基)苯甲酸3-(硝氧甲基)苯酯(NCX-4016,5)和(+/-)(E)乙基-2-[(E)羥亞氨基]-5-硝基-3-己烯酰胺(FK409)，該藥能抑制多種誘導劑引起的血小板聚集和血栓形成，對胃腸道無明顯不良反應。臨床口服NCX-4016,5一周后可產生同阿司匹林等效的抗血小板聚集作用，且未發現胃腸道損傷。FK409具有抗心絞痛、擴張冠狀動脈及抑制血小板聚集作用，作用機制與在體內釋放NO有關，已用于急性心肌缺血和動脈成形術后狹窄的實驗治療，目前正進行Ⅱ期臨床研究[29,33-34]。

5 結 語

血小板發揮其止血等作用，都是通過其表面膜蛋白受體激活，產生一系列信號傳遞路徑來實現的，隨著生物化學、細胞生物學與分子生物學的迅速發展，人們對血小板活化的過程和機制，特別是信號傳遞在血小板活化中的作用有了一定認識，但對血小板信號轉導作用機制仍然缺乏全面清晰的了解。盡管目前已有的抗血小板藥物的積極應用，但心腦血管病事件的發生率仍然很高，所以，進一步研究血小板活化及信號轉導機制，對于闡明血小板的病理生理變化、血栓性疾病防治具有重要意義，也為開發新型抗血小板藥物等提供理論指導。

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