MicroRNA在HPV相關宮頸癌中的研究進展

張祖雯(綜述),趙菊梅(審校)

(延安大學醫學院，陜西 延安716000)

宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度及發病率僅次于乳腺癌排第2位，病死率居第5位，是威脅女性健康、導致婦女死亡的主要惡性腫瘤之一[1-2]。據統計，全球每年約有50萬宮頸癌新發病例，占所有癌癥新發病例的5%[3]。宮頸癌的發生、發展、侵襲轉移是一個極其復雜的過程，它是由正常宮頸上皮細胞從增生到化生、從化生再到不典型增生、最后癌變的一個由多基因、多階段異常調控的過程。大量研究已經證實[4-6]，人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的感染與宮頸癌的發生、發展密切相關，是宮頸癌發生的必要條件，但單純的HPV感染并不能直接導致宮頸癌。近年來眾多研究者在對HPV感染和致癌過程中微RNA(microRNA，miRNA)的表達水平及調控機制進行了一定的研究，發現某些miRNA與HPV有協同或拮抗作用。這為研究宮頸癌的發生、發展提供了理論依據，為宮頸癌的基因診斷、治療提供了新的方向。

1 miRNA的概述

1.1miRNA的概念與發現 miRNA是一類廣泛存在于動植物體內的高度保守的小分子非編碼核糖核酸，是一類長度為18～24個核苷酸(nt)的單鏈RNA 分子片段[7]。首次被發現的miRNA是miRNA lin-4,是在1993年由Lee等[8]在對秀麗隱桿線蟲(caenorhabditis elegan)進行遺傳學分析時首次發現并報道的。隨后在2000年的《Nature》雜志和2001年的《Science》雜志上相繼對miRNA的研究進行了報道，2002年12月19日《Science》雜志將miRNA評為2002年世界十大科技突破之一，引起了世界眾多學者的關注，隨后miRNA的研究得到了空前的發展，據miRBase(http://www.mirbase.org/)的最新數據顯示，已有24 521種miRNA(miRBase Release 20 B2013.6)被發現，廣泛存在于多個物種體內，如動物、植物、寄生蟲、DNA病毒等。人源性的miRNA已被證實的已有1872種(miRBase Release 20 B2013.6)[9-12]。

1.2miRNA的作用機制 miRNA的主要作用是調控靶mRNA的表達，進而影響機體生理、病理功能，如機體的生長發育、細胞的凋亡以及疾病與腫瘤的發生、發展等。miRNA的主要調控機制是成熟miRNA的5′端第2～8個核苷酸序列與靶mRNA的3′端非編碼區相互識別配對[13]。有研究發現，超過60%的人類編碼基因可與miRNA進行選擇性配對[14]，且根據序列互補的程度,完全互補miRNA可導致靶mRNA的降解，不完全互補抑制靶mRNA 的翻譯[15]。除了上述作用外，在Vasudevan等[16]的研究還發現，miRNA在有些哺乳動物細胞中可以使目標基因的表達上調，從而發揮正向調節基因表達的作用。

2 miRNA與宮頸癌

宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，現已證實miRNA在癌組織及血清中的異常表達與宮頸癌的發生、發展、轉移及耐藥有密切關系。Yao等[17]的研究發現,miR-21有明顯的促瘤生長作用,而且驗證程序性細胞死亡因子4的3′非翻譯區(PDCD4-3′UTR)18 bp靶位是miR-21的唯一的調控位點。Hu等[18]的研究發現，miR-200a和miR-9對宮頸癌患者的預后有重要意義，其中miR-200可以通過調節細胞的黏附和抑制基因的表達來影響宮頸癌細胞的轉移，而miR-9則通過調節腫瘤細胞的新陳代謝在腫瘤細胞的轉移中發揮潛在的作用。Lee等[19]的研究發現，miR-199a可能是宮頸癌基因治療的一個潛在靶點，他們利用anti-miR-199a及與順鉑聯合的anti-miR-199a轉染宮頸癌細胞株，發現兩組培養細胞均受到抑制，且聯合組抑制作用更明顯，還存在著劑量-效應關系。雖然對于miRNA在宮頸癌中的發生、發展、侵襲轉移及預后都有研究，但是miRNA在宮頸癌中具體的作用機制尚未明確，還需要繼續探索、研究[20]。

3 miRNA在HPV相關宮頸癌中的研究現狀

盡管已經證實HPV與宮頸癌的發生密切相關，但有研究證實單純的HPV感染并不能直接導致宮頸癌。近年來，隨著對miRNA在宮頸癌發病機制研究的不斷深入，越來越多的研究者將目光轉移到miRNA與HPV的聯系上。有研究發現，在HPV整合位點附近發現約有53個miRNA基因，且出現的頻率高達73%，而檢測出的miRNA約有39個曾研究與腫瘤的發生有關[21]。因此，在HPV(+)的宮頸癌患者中miRNA的異常表達可能與HPV的感染有著密切的聯系。下面就近幾年在研究HPV相關宮頸癌患者中miRNA的表達特征及其調控機制等方面的文獻進行總結。

3.1miRNA與HPV相關宮頸癌表達譜的研究 李陽[22]利用生物芯片技術和高通量技術等通過miRNA組學、轉錄組學和HPV的宏基因組學水平研究篩選了可以用于HPV感染和宮頸病變發生過程中早期診斷、預測和靶向治療的miRNA標志物，對比分析了6例HPV(-)正常宮頸組織、7例單純HPV16(+)正常宮頸組織、6例單純HPV16(+)宮頸上皮內瘤變(cervical interaepithelial neoplasia,CIN)Ⅱ～Ⅲ期的宮頸組織和6例單純HPV16(+)宮頸癌組織中的不同miRNA表達特征,并通過芯片差異顯著性分析和深度分析,篩選宮頸癌發生過程中差異表達的miRNA,并通過實時聚合酶鏈反應技術驗證miRNA芯片數據的準確性。結果發現：在這4組研究數據中有52個miRNA的表達有統計學意義(P<0.05),其中31個miRNA在HPV(-)正常宮頸組織、HPV16(+)CINⅡ～Ⅲ、HPV16(+)宮頸癌組織3組中有統計學意義(P<0.05)。在該研究中識別了不同HPV感染狀態的宮頸組織miRNA表達譜,31個miRNA可能與HPV(+)的宮頸癌發生相關，并且發現隨著宮頸病變的進展,miR-375,miR-29a,miR-99a,miR-195的表達呈下調趨勢，miR-92a,miR-155的表達呈上調趨勢，說明這些miRNA與HPV(+)宮頸癌的發展有密切關系。利用miRNA靶體數據庫和基因GENE數據庫,篩選了與HPV感染相關的miRNA靶基因,構建了“HPV感染相關miRNA/靶體基因網絡圖，并且發現miR-29可能是與HPV致癌過程關系最為密切的miRNA。Rao等[23]利用miRNA基因芯片(microarray chips with 924 probes)技術比較分析了感染HPV16和(或)HPV18的13例宮頸癌患者(11例宮頸鱗癌,1例宮頸腺癌,1例子宮頸肉瘤)的宮頸癌組織及相鄰正常宮頸組織中miRNA的表達的差異，發現在宮頸癌組織中有18種miRNA明顯上調，19種miRNA明顯下調。此研究結果顯示，HPV(+)的宮頸癌組織的miRNA的表達與鄰近的正常宮頸組織的miRNA表達有差異。由此推斷，miRNA的異常表達與HPV相關性宮頸癌的發生、發展是有密切關系的。

3.2miRNA在HPV相關宮頸癌中的功能、表達調控機制及潛在臨床意義的研究

3.2.1miRNA-218 Martinez等[20]利用實時定量聚合酶鏈反應技術和RNA印跡技術比較分析了HPV16(+)宮頸癌細胞株和HPV(-)宮頸癌細胞株中miRNA表達譜的差異，發現miR-218在HPV(+)宮頸癌細胞株中表達下調，還發現miR-218的作用靶點就是特異性上皮細胞標志物層粘連蛋白3的基因，而且發現HPV16(+)宮頸癌細胞中原癌基因E6能夠抑制miR-218的表達，并且利用RNA干擾技術抑制原癌基因E6/E7后miR218的表達卻上調。為了更進一步地了解miR-218與HPV感染性宮頸癌的相關性，Gao等[24]研究發現，高危型HPV感染者miR-218表達水平顯著低于HPV低危、中危及HPV(-)感染者的miR-218表達水平，而且高級別宮頸上皮內瘤變患者miR-218的表達水平顯著低于低級別宮頸上皮內瘤變者。因此推斷，高危型HPV感染可以下調miR-218表達，并且miR-218低表達可能與HPV(+)宮頸癌的發病機制密切相關。

3.2.2miR-29 李陽[22]利用高通量技術對HPV相關全基因組分析時發現，miR-29可能是與HPV致癌過程關系最為密切的miRNA，miRNA可能通過細胞周期等生物學功能參與HPV相關的宮頸癌發生過程。李陽[22]又通過體內宮頸組織標本相關性分析和體外功能學試驗研究發現，miR-29通過靶向作用陰陽因子1和細胞周期蛋白依賴性激酶6來調控細胞的周期和凋亡,促進HPV誘導的細胞惡性轉化過程,從而參與宮頸癌的發生。

3.2.3miR-34 在Wang等[25]的研究中發現，HPV能通過HPV16(+)和HPV18(+)的E6癌基因直接和間接地影響miR-34，使其表達下調。另有研究結果顯示，HPV病毒感染的早期蛋白E6可能通過導致miR-34a的低表達來阻斷抑癌基因p53的表達，從而對腫瘤的發生、發展產生作用[26]。

3.2.4miR-16 近期，林茂等[27]研究設計了三條Dicer基因的小干擾RNA(small interfering，siRNA)，對HPV18陽性的HeLa229細胞實施干預，在不同濃度(40、60及80 nmol/L)、不同時間(24、48及72 h)的條件下干預后通過定量聚合酶鏈反應技術分析發現，40 nmol/L的Dicer siRNA干預可顯著下調HPV18 E6、E7及miR-16基因表達，而且發現HPV18 E6、E7基因編碼區存在miR-16的結合位點。因此,推斷Dicer siRNA干預能顯著下調高危型HPV18E6、E7基因的表達，miR-16可能參與HPV18E6、E7基因表達調控。

3.2.5miRNA-145 在Gunasekharan等[28]的研究中發現，miR-145在 HPV(+)細胞內的高表達降低了HPV基因的擴增及后期表達，還發現miRNA-145的目標序列在HPV 31 E1和E2基因的開放閱讀區，研究結果顯示，HPV可以調節miR-145的表達來控制自己的生命周期。

3.2.6miR-99b 在吳維光[29]的研究中發現，HPV(+)宮頸腺癌組織共有15條miRNA基因表達發生變化，其中上調表達的11個，下調表達的4個,而且發現miR-99b表達上調的HeLa細胞生殖率降低、凋亡率增加，HeLa細胞的移植瘤生長減慢，移植瘤微血管形成減少；在miR-99b表達上調的HeLa細胞中共有69個基因表達發生變化，其中上調表達的有43條，下調表達的有26條。因此得出結論:HPV(+)的宮頸腺癌組織中表達下調的miR-99b參與了HPV誘導宮頸腺上皮細胞惡性轉化過程。

3.2.7其他 在Gu等[30]的研究中發現，miR-466、miR-467和miR-669是常見且特定于黏膜HPV(HPV6、HPV11、HPV16和HPV18)的類型，并且應用Northern印跡雜交技術證實了這幾種miRNA是由HPV(+)宮頸癌細胞系中的人類黏膜乳頭瘤病毒(mucosal HPV)編碼的。

4 小 結

miRNA的發現是醫學研究領域的重大突破，為人們了解基因和基因的表達調節機制方面提供了新的視角，更使人們對腫瘤的發生、發展有了新的認識。HPV雖然已經是宮頸癌發生的確定因素，但其導致宮頸癌的機制相當復雜，把HPV和miRNA聯系起來研究宮頸癌發生、發展、侵襲轉移是當下研究的熱點。目前對HPV和miRNA在宮頸癌中相互關系的研究還處在起步階段，對于HPV和miRNA之間的聯系和在宮頸癌發生、發展中的作用機制還不是很明確，但是許多研究提示HPV和miRNA之間可能存在著某種協同或者拮抗作用，明確兩者間的關系能為研究者在宮頸癌的病因學、分子病理學和基因診斷及治療方面的研究提供新的思路。

[1] Ili CG,Brebi P,López J,etal.Genotyping of human papillomavirus in cervical intraepithelial neoplasia in a highrisk population[J].J Med Virol,2011,83(5):833-837.

[2] Nam EJ,Kim JW,Kim SW,etal.The expressions of the Rb pathway in cervical intraepithelial neoplasia; predictive and prognostic significance[J].Gynecol Oncol,2007,104(1):27-211.

[3] Valdespino VM,Valdespino VE.Cervical cancer screening:state of the art[J].Curr Opin Obstet Gynecol,2006,18(1):35-40.

[4] Cai HB,Ding XH,Chen CC.Prevalence of single and multiple human papillomavirus types in cervical cancer and precursor lesions in Hubei，China[J].Oncology,2009,76(3):157-161.

[5] Wentzensen N,Wilson LE,Wheeler CM,etal.Hierarchical clustering of human papilloma virus genotype patterns in the ASCUSLSIL triage study[J].Cancer Res,2010,70(21):8578-8586.

[6] Giorgi Rossi P,Chini F,Bisanzi B,etal.Distribution of high and low risk HPV types by cytological status:a population based study from Italy[J].Infect Agent Cancer,2011,6:2.

[7] Kuhlmann JD,Rasch J,Wimberger P,etal.microRNA and the pathogenesis of ovarian cancer—a new horizon for molecular diagnostics and treatment[J].Clin Chem Lab Med,2012,50(4):601-615.

[8] Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V.The C.elegans heteroch ronic gene lin-4 encodes small RNA with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[9] Hammond SM,Bernstein E,Beach D,etal.An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells[J].Nature,2000,404(6775):293-296.

[10] Reinhart BJ,Slack FJ,Basson M,etal.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans[J].Nature,2000,403(6772):901-906.

[11] Lee RC,Ambros V.An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans[J].Science,2001,294(5543):862-864.

[12] Lagos-Quintana M,Rauhut R,Lendeckel W,etal.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J].Science,2001,294(5543):853-858.

[13] Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell,2005,120(1):15-20.

[14] Friedman RC,Farh KK,Burge CB,etal.Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs[J].Genome Res,2009,19(1):92-105.

[15] Eulalio A,Huntzinger E,Nishihara T,etal.Deadenylation is a widespread effect of miRNA regulation[J].RNA,2009,15(1):21-32.

[16] Vasudevan S,Tong Y,Steitz JA.Switching from repression to activation:microRNAs can up-regulate translation[J].Science,2007,318(5858):1931-1934.

[17] Yao Q,Xu H,Zhang QQ,etal.MicroRNA-21 promotes cell proliferation and down-regulates the expression of programmed cell death 4(PDCD4)in HeLa cervical carcinoma cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,388(3):539-542.

[18] Hu X,Schwarz JK,Lewis JS Jr,etal.A microRNA expression signature for cervical cancer prognosis[J].Cancer Res,2010,70(4):1441-1448.

[19] Lee JW,Choi CH,Choi JJ,etal.Altered microRNA expression in cervical carcinomas[J].Clin Cancer Res,2008,14(9):2535-2542.

[20] Martinez I,Gardiner AS,Board KF,etal.Human papillomavirus type 16 reduces the expression of microRNA-218 in cervical carcinoma cells[J].Oncogene,2008,27(18):2575-2582.

[21] Nambaru L,Meenakumari B,Swaminathan R,etal.Prognostic significance of HPV physical status and integration sites in cervical cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev,2009,10(3):355-360.

[22] 李陽.基于高通量技術的HPV相關全基因組分析及特定miRNA在宮頸癌發生中的作用與機制[D].杭州：浙江大學，2012.

[23] Rao Q,Shen Q,Zhou H,etal.Aberrant microRNA expression in human cervical carcinomas[J].Med Oncol,2012,29(2):1242-1248.

[24] Gao C,Zhang Z,Liu W,etal.Reduced microRNA-218 expression is associated with high nuclear factor kappa B activation in gastric cancer[J].Cancer,2010,116(1):41-49.

[25] Wang X,Wang HK,McCoy JP,etal.Oncogenic HPV infection interrupts the expression of tumor-suppressive miR-34a through viral oncoprotein E6[J].RNA,2009,15(4):637-647.

[26] Li B,Hu Y,Ye F,etal.Reduced miR-34a expression in normal cervical tissues and cervical lesions with high-risk human papillomavirus infection[J].Int J Gynecol Cancer,2010,20(4):597-604.

[27] 林茂，盧徐漣，胡飛紅,等.Dicer干預對HPV18 E6/E7 基因表達的影響[J].溫州醫學院學報，2013，43(2)：101-105.

[28] Gunasekharan V,Laimins LA.Human papillomaviruses modulate microRNA 145 expression to directly control genome amplification[J].J Virol,2013,87(10):6037-6043.

[29] 吳維光.HPV陽性宮頸腺癌相關miRNAs篩選和功能分析[D].廣州：中山大學，2008.

[30] Gu W,An J,Ye P,etal.Prediction of conserved microRNAs from skin and mucosal human papillomaviruses[J].Arch Virology,2011,156(7):1161-1171.