心肌梗死后心肌組織內環境對移植干細胞心肌內存活、分化影響

艾 旗，袁春菊(綜述)，余國龍(審校)

(中南大學湘雅醫院心內科，長沙 410008)

目前多個實驗及臨床研究[1-2]表明，經心肌、冠狀動脈及靜脈三類干細胞移植途徑治療急性心肌梗死，干細胞在心肌內存活、分化不足，心功能增加僅達10%，甚至近期國外實驗與臨床研究報道的結論為陰性結果[3-4]。干細胞在心肌內存活、分化不足使干細胞移植療法停滯不前。因此，如何增加干細胞在心肌內存活、分化，提高干細胞移植治療心肌梗死療效是目前急需解決的主要問題。

1 心肌梗死后心肌內環境變化

心肌內環境對干細胞在心肌內存活、分化起決定性作用。心肌內環境是心肌細胞賴以生存的環境，心肌細胞、間質細胞、成纖維細胞產生或分泌的細胞外基質成分及某些生物活性分子,對心肌細胞發揮支持、連接、營養和保護等作用[5]。急性心肌梗死發生后，繼發于心肌細胞壞死，外周血中性粒細胞和單核細胞短時間內募集到受損壞死心肌組織。心肌梗死急性期心肌組織內微環境突出表現為大量中性粒細胞、單核細胞浸潤和腫瘤壞死因子α、白細胞介素(interleukin,IL)1β、IL-6等促炎因子顯著增加。同時，心肌梗死后氧化應激反應增加，有氧代謝抑制，代謝物質堆積，pH值下降、滲透壓升高及其細胞外基質降解[5-6]。

2 移植干細胞在心肌梗死后心肌內環境存活

Geng等[7]用骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)移植治療心肌梗死,治療后2 h移植細胞開始發生死亡,4 d內定植在心肌內移植MSCs細胞99%發生死亡,即使將移植的MSCs數增加到25倍也未能明顯改善移植效果。Hale等[4]用骨骼肌成肌干細胞移植治療大鼠心肌梗死,證實注射在心肌內骨骼肌成肌干細胞90%以上在24 h內發生凋亡或壞死。Azarnoush等[8]研究顯示，骨骼肌成肌干細胞與低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)聯合注射于心肌梗死部位，心肌內移植細胞仍然在24 h內死亡超過76%,僅有15%移植細胞存活超過12周。Fernanda等[9]研究顯示,即使心肌內注射自身同基因的骨髓干細胞，72 h后心肌組織內僅有5%移植細胞存活。Mouquet等[10]和Joggerst等[11]分析多項實驗研究均證實,大多數干細胞在移植到受損心肌組織4 d內凋亡和丟失。

3 移植干細胞在心肌梗死后心肌內環境分化

傳統觀點認為心肌細胞是終末分化細胞,壞死心肌不能再生,只能由瘢痕替代,導致心室重構造成頑固性心力衰竭，干細胞移植到心肌梗死后缺血病變區能夠替代、修復受損心肌[1]。部分學者認為干細胞移植后在心肌內環境下分化為心肌樣細胞及血管內皮細胞，重建缺血區的微循環及激活心肌內干細胞而明顯改善心功能[12-13]。多項實驗研究證實，內環境是干細胞定向分化的決定因素[13]，內環境中組織細胞、細胞基質和細胞因子與干細胞相互作用，而決定干細胞分化方向與進程。Wang等[14]發現，MSCs可在心臟微環境的誘導下分化為心肌細胞，并可明顯改善受損心臟的功能。心肌梗死局部組織合成和釋放骨形態發生蛋白2、胰島素樣生長因子1和IL-1β等細胞因子增多[15]。體外實驗表明，骨形態發生蛋白2、胰島素樣生長因子1和IL-1β等生物因子與MSCs表面受體結合，從而激活Smad和磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶信號途徑，調控MSCs向心肌細胞分化[16]。

4 心肌內環境對移植干細胞存活、分化的影響

4.1炎癥微環境 曹豐等[17]在大鼠心肌梗死模型制備后不同時間移植MSCs，以觀察心肌梗死后不同程度的炎性反應對MSCs在大鼠梗死心肌中存活、分化的影響。結果顯示，局灶炎性反應在心肌梗死后第1周最強，第2周時減弱，第4～8周炎性反應消退，瘢痕完全形成。如MSCs第1周移植，心肌組織內未發現有移植細胞存活,心功能及瘢痕面積與對照組無差異；而第2～4周MSCs移植，心肌組織中可觀察到大量MSCs存在,并向周圍遷移分布,且與對照組比較，心功能及瘢痕面積均有顯著改善。Hu等[18]采用大鼠心肌梗死模型研究發現，心肌梗死后7 d是干細胞存活率最佳時期，得到干細胞最大存活率。目前大多數實驗研究均提示，干細胞移植最佳時期是在炎癥減退、瘢痕形成前的心肌梗死后病程的1～2周[19]。

心肌梗死后炎癥微環境促進移植干細胞歸巢，部分因素有利于移植干細胞分化。實驗研究發現，心肌梗死后，梗死局部心肌細胞釋放細胞因子白細胞介素1β、腫瘤壞死因子α，通過Smads、p38絲裂素活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3-激酶等3條信號通路轉導，誘導移植細胞表達特異心肌蛋白，分化為心肌樣細胞[20]。Kobayashi等[21]的大鼠模型研究顯示，MSCs移植誘導的血管生成、新生的心肌細胞與IL-1β的表達增加呈正相關。因此，炎癥微環境不利于移植干細胞的存活、分化，而隨后產生一些細胞因子又可促進干細胞分化。

4.2缺血、缺氧環境 心肌梗死后，心肌組織缺氧、血流動力學改變可促使心肌組織合成腫瘤壞死因子α，其細胞毒效應引起心肌細胞凋亡和壞死[22]。Zhu等[23]發現缺血、缺氧能夠通過激活caspase-3,從而誘導心肌細胞凋亡，MSCs在這種缺血、缺氧的微環境中同樣易發生凋亡，從而降低其在心肌組織中的存活率。數個實驗研究證實在缺氧的條件下血管內皮生長因子分泌增加,促進內皮細胞分裂增殖、趨化和遷移;還能動員骨髓中的內皮祖細胞進入外周循環,并歸巢于缺血組織，在缺血區分化為成熟的內皮細胞，從而形成新生血管，為移植細胞提供更多的血液供應[24]。因此，缺血、缺氧環境有不利于干細胞存活、分化的一面，同時也有有利的一面。

4.3氧化產物 在心肌缺血、缺氧性損傷和缺血/再灌注過程中，由于活性氧化產物即活性氧類(reactive oxygen species,ROS)清除系統功能降低，生成系統活性增強，引起ROS大量產生和堆積，從而導致MSCs移植后存活率很低，極大地限制了MSCs的治療效果[25]。Xu等[26]發現，活性氧化物通過磷脂酰肌醇3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶信號分子介導細胞凋亡。氧化應激被證實參與了心肌梗死后的MSCs凋亡過程，從而不利于移植干細胞在心肌內的存活。

近年來，越來越多的研究表明，ROS不僅參與氧化應激的病理過程，還參與許多生理過程的調節，如細胞的增殖、遷移、分化等[1,3]。近期實驗研究發現，H2O2刺激增加N-ras基因細胞內ROS水平，并改變細胞的形態和遷移能力，增加干細胞遷移與活性；血管內皮生長因子介導的平滑肌細胞遷移需要ROS[27]。因此，ROS對干細胞的存活、分化有有利的一面。

4.4周圍正常心肌細胞 Fukuhara等[28]通過體外細胞培養證實了干細胞與心肌細胞直接的電機械刺激是干細胞心肌環境依賴性分化的必要條件，他們發現隨著共培養時間的增加，干細胞表達心肌特異性蛋白的陽性率也隨之增加。Xue等[29]將人類胚胎干細胞與大鼠心肌細胞共同培養,可誘導人類胚胎干細胞向心肌細胞分化，分化的心室肌細胞表現為擬胚體的節律性收縮與大鼠組織的電活動同步，且細胞連接處縫隙連接蛋白43免疫染色陽性。Condorelli等[30]研究發現，僅有與心肌細胞發生直接接觸的內皮細胞方能分化為心肌細胞，表明細胞的直接接觸可能是影響干細胞定向分化的關鍵因素。因此，梗死區周邊正常心肌細胞對促進干細胞的分化起到一定作用。

5 展 望

心肌內環境對于移植干細胞存活率和向心肌細胞分化效率起決定性作用。炎癥微環境、缺血、缺氧，氧化應激等惡劣心肌內環境可導致心肌梗死后移植干細胞存活率、分化率降低；同時，缺血的心肌微環境激活又可誘導干細胞存活和分化的生物因子分泌或干細胞內信號通道,促進干細胞存活及向心肌細胞分化。因此，進一步研究心肌梗死后內環境對干細胞存活、分化的影響對干細胞治療心肌梗死的臨床應用推廣具有重要意義。

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