蝦青素對四氯化碳誘導的慢性肝損傷大鼠的保護作用

黃鐵軍，余瓊華，戴列軍

·實驗性肝炎·

蝦青素對四氯化碳誘導的慢性肝損傷大鼠的保護作用

黃鐵軍，余瓊華，戴列軍

目的探討蝦青素對慢性肝損傷大鼠肝功能的保護作用。方法采用四氯化碳（CCl4）制備大鼠慢性肝損傷模型，設正常組、模型組、蝦青素干預組。通過酶聯免疫法測定血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）以及肝組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽轉移酶（glutathione-S-transfcrase，GST）活性、谷胱甘肽（glutathione，GSH）及丙二醛（malondialdehyd，MDA）水平。對肝組織病理切片行Masson三色染色，檢測肝纖維化情況，采用RT-PCR法檢測Ⅰ型膠原mRNA水平。結果正常組大鼠肝膠原指數為（0.42±0.12），模型組大鼠肝膠原指數為（1.84±0.24，P＜0.01），蝦青素治療組肝膠原指數為（0.89±0.12）,顯著低于模型組（P＜0.05）；正常大鼠肝組織Ⅰ型膠原mRNA水平為（0.12±0.02），模型組為（0.48± 0.06，P＜0.01），蝦青素治療組為（0.35±0.09），明顯低于模型組（P＜0.05）；正常組肝組織MDA、GST、GSH和SOD水平分別為（1.93±0.76）nmol/mg、（18.43±5.34）U/mg、（75.45±9.67）mg/g、（678.80±76.56）U/mg，模型組MDA和GST分別為（6.56±1.09）nmol/mg、（54.34±7.65）U/mg，均顯著升高（P＜0.05），而GSH為（35.45±9.01）mg/g，SOD為（203.89±89.00）U/mg，均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比，蝦青素治療組MDA為（3.34±1.12）nmol/mg，GST為（30.89±4.78）U/mg，均顯著低于模型組（P＜0.01），而GSH為（56.78±7.78）mg/g，SOD為（432.34±92.56）U/mg，均較模型組顯著升高（P＜0.01）。結論蝦青素可以緩解四氯化碳誘導的大鼠慢性肝損傷，其可能機制與提高抗氧化能力有關。

慢性肝損傷;蝦青素;氧化應激；保護作用

蝦青素（Astaxanthin）又名蝦黃質，或龍蝦殼色素，化學名稱為3，3'-二羥基-4，4'-二酮基-β，β'胡蘿卜素。蝦青素主要存在于海洋動植物中，特別是在水生的蟹、魚蝦和鳥類的羽毛中。因其化學結構中存在共軛雙鍵鏈的末端，還有不飽和的酮基和羥基，而酮基和羥基又構成α-羥基酮，該物質具有較為活潑的電子效應，能通過吸引自由基或向自由基提供電子，從而具有較強的清除自由基能力和抗氧化能力。本研究采用四氯化碳致大鼠慢性肝損傷模型，探討天然蝦青素對慢性肝損傷的治療療效以及對氧化應激的影響，為應用蝦青素保護慢性肝損傷的作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要藥物和試劑成年健康清潔級雄性SD大鼠30只，體質量180～220g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。四氯化碳（CCl4，批號：130710，天津化學試劑研究所）；兔抗Ⅰ型膠原多克隆抗體（批號：201211，武漢博士德生物技術有限公司產品）；Masson染色試劑盒（批號：120810，上海博谷生物）；檢測ALT、AST、ALP、TP試劑盒（批號：201235，南京建成生物工程研究所）；天然蝦青素（批號：201201，荊州市天然蝦青素有限公司）；檢測SOD、GSH、MDA、GST試劑盒（批號：201103，南京建成生物工程公司）；檢測ⅢPC、LN、Ⅳ-C和HA（批號：201304，北京熱景生物技術有限公司）。

1.2 動物分組和模型制備所有動物自由進食和飲水，在適宜的溫度和濕度下飼養，光明與黑暗各12小時循環。將30只動物隨機分成正常對照組、慢性肝損傷組和蝦青素干預組。實驗組大鼠先予后肢內側皮下注射50%四氯化碳/花生油溶液0.2 mg/100 g，2次/ w。左右腿交叉注射，共6 w，建立大鼠慢性肝損傷模型。正常對照組動物予以相同劑量的生理鹽水注射。在蝦青素干預組，于建模結束后給予400 mg·kg-1蝦青素灌胃，正常對照組和慢性肝損傷模型組予以相同劑量的生理鹽水灌胃,干預時間為2 w。

1.3 血指標檢測采用化學比色法檢測肝組織超氧化物歧化酶、谷胱甘肽轉移酶活性，及谷胱甘肽和丙二醛水平；采用化學比色法檢測血生化指標。

1.4 肝組織學檢查在實驗結束時，大鼠禁食水，稱體質量。處死動物，取肝臟和血，稱肝質量，計算肝指數，肝指數=肝質量/體質量×100%。采用Masson染色，隨機選取10個高倍視野，應用Image-Pro Plus 6.0軟件計算膠原陽性面積占整個視野面積的百分比，即膠原指數；采用RT-PCR法檢測肝組織I型膠原mRNA，即取100毫克大鼠肝組織，采用TRIzol法抽提RNA，總反應體系20μL，42℃水浴1h，合成第一鏈cDNA。取上述逆轉錄產物1μL作為反應模板，反應體系為25μL。I型膠原Forward：5'-TACAGCACGCTTGTGGGATG-3'；Reverse：5'-TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC-3'，進行擴增。同法擴增GAPDH作為內參照。以5μL PCR產物在凝膠上電泳，攝像，存入計算機，并作圖像分析。

1.5 統計學分析應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以（）表示，多組間均數的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況正常對照組大鼠生長狀況良好；慢性肝損傷大鼠一般情況差，精神萎靡，皮毛光澤度欠佳，體質量增長速度明顯減慢，肝指數明顯升高；蝦青素干預組大鼠體質量增長較正常對照組稍緩慢，肝指數亦明顯升高，但明顯低于模型組（P＜0.05）。蝦青素干預組與模型組間體質量和肝質量差異無統計學意義（表1）。

表1 大鼠體質量和肝指數（）的比較

表1 大鼠體質量和肝指數（）的比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

例數體質量（g）肝質量（g）肝/體比值正常組10247.00±7.689.60±1.083.56±0.25模型組10323.23±8.87①12.33±1.87①4.87±0.30①蝦青素10289.43±15.4510.43±3.453.90±0.34②

2.2 肝組織病理學表現正常大鼠僅在匯管區和中央靜脈區見少量的膠原纖維，肝膠原指數為（0.42±0.12）；肝損傷模型大鼠肝內形成彌散的致密性纖維組織，肝小葉結構紊亂，伴大小不一的亞假小葉結構，肝膠原指數為（1.84±0.24），與正常對照相比，膠原指數明顯增加（P＜0.01）；與模型組比，蝦青素處理組動物肝內亞假小葉結構明顯減少，肝膠原指數為（0.89±0.12）,肝內膠原沉積明顯減少，且小葉結果紊亂程度減輕（圖1～3）。此外，還發現正常組大鼠肝組織無細胞變性，而模型組肝組織脂肪變性較為明顯，經蝦青素處理后脂肪變性減輕。

2.3 血生化指標的變化與模型組大鼠相比，蝦青素干預組血生化指標明顯降低（P＜0.05，表2）。

2.4 肝組織Ⅰ型膠原mRNA水平比較正常肝組織Ⅰ型膠原mRNA水平為（0.12±0.02），模型組為（0.48± 0.06），顯著高于正常組（P＜0.01）；與模型組比，蝦青素處理組（0.35±0.09）明顯降低（P＜0.01），圖4。

2.5 大鼠肝組織氧化應激指標的變化與正常組比較，模型組大鼠肝組織GST活性和MDA水平顯著升高（P＜0.05），而SOD活性和GSH水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組大鼠相比，蝦青素干預組肝組織MDA水平和GST活性顯著降低（P＜0.01，表3）。

圖1 正常對照組肝小葉結構完整，無細胞變性壞死，無炎性細胞浸潤及無膠原沉積（Masson，200×）

圖2 模型組肝小葉結構破壞，細胞變性嚴重，明顯的脂肪變，炎性細胞浸潤及膠原增生嚴重（Masson，200×）

圖3 蝦青素處理組肝小葉結構破壞減輕，細胞變性較少，較少炎性細胞浸潤及較輕的膠原增生（Masson，200×）

圖4 各組大鼠肝組織Ⅰ型膠原mRNA水平比較與正常組比，①P＜0.01；與模型組比，②P＜0.01

表2 各組大鼠血生化指標（）的比較

表2 各組大鼠血生化指標（）的比較

與正常組比,①P＜0.01；與模型組比，②P＜0.01

例數AST（U/L）ALT（U/L）ALP（U/L）TP（g/L）正常組10140.4±16.743.7±7.089.9±9.674.4±10.0模型組10323.3±65.6①98.9±9.8①197.9±34.9①72.2±9.1干預組10200.9±43.8②70.5±8.8②156.9±12.8②69.9±8.9

表3 各組大鼠氧化應激指標（）的比較

表3 各組大鼠氧化應激指標（）的比較

與正常組比,①P＜0.05，②P＜0.01；與模型組比，③P＜0.01

例數MDA（nmol/mg）GST（U/mg）GSH（mg/g）SOD（U/mg）正常組101.93±0.7618.43±5.3475.45±9.67678.80±76.56模型組106.56±1.09①54.34±7.65①35.45±9.01②203.89±89.00②蝦青素103.34±1.12③30.89±4.78③56.78±7.78③432.34±92.56③

3 討論

慢性肝損傷是機體在應對各種生物或者非生物等致病因子刺激過程中所致肝實質細胞和非實質細胞受損。若致病因子長時間存在，會導致肝細胞變性、壞死，甚至肝組織內膠原沉積，導致肝纖維化,最終可以導致肝功能障礙，甚至肝衰竭[1，2]。在慢性肝損傷發生發展過程中，存在諸多的病理生理方面的改變，其中氧化應激在慢性肝損傷的發生發展進程中起著不容忽視的作用[3～5]。在生理情況下，機體氧化應激和抗氧化應激系統處于穩態平衡狀態，即體內產生以MDA為代表的氧自由基形成和脂質過氧化反應的終末產物，以及以還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶為代表的保護性抗氧化物質，使之處于動態平衡狀態。在慢性肝損傷過程中，這種平衡被打亂，導致氧化損傷[6～8]。

采用合適的動物模型研究慢性肝損傷至關重要。本實驗采用四氯化碳誘導慢性肝損傷模型，該模型具有重復性好和成功率高等優點[9]。在不同方法建立的動物模型，其慢性肝損傷形成的機制不同。在四氯化碳誘導的慢性肝損傷，其主要機制是CCl4通過細胞色素氧化酶代謝為活性氧三氯甲基[10]。過多活性氧超出了體內抗氧化物的清除能力，使氧化系統和抗氧化系統之間的動態平衡被打破，最終導致肝臟損傷[11]。該實驗在造模過程中通過對其氧化應激相關指標檢測，發現模型組大鼠肝組織GST活性和MDA水平顯著升高，而SOD活性和GSH水平顯著降低，這一結果恰恰也證實氧化應激在慢性肝損傷中發揮著重要作用。

慢性肝損傷在肝臟形態結構以及功能上有一定的反映。在形態上，可出現肝臟脂肪變性、壞死，若慢性損傷持續存在，可導致肝纖維化[12～14]；在功能上，反映出相關血清酶升高和合成功能障礙。本實驗中，慢性肝損傷模型大鼠肝臟出現細胞變性，其中脂肪變性尤為明顯。另外，還出現了肝纖維化。在肝功能受損方面，表現出丙氨酸氨基轉移酶和天冬氨酸氨基轉移酶明顯升高。在經過蝦青素干預后，慢性肝損傷大鼠肝臟脂肪變性好轉，肝纖維化面積、Ⅰ型膠原mRNA水平降低。同時，反應肝功能受損的丙氨酸氨基轉移酶和天冬氨酸氨基轉移酶也降低，說明蝦青素可能抑制了慢性肝損傷的發展。實驗還發現蝦青素可明顯降低肝組織MDA和GST水平，提高GSH水平和SOD活性，提示其具有抗氧化能力。蝦青素作為自然界存在的一種具有高度活性的化合物，其抗氧化性能主要表現在淬滅單線態氧，清除自由基，降低膜的流動性，穩定膜結構，增加抗氧化酶的活性，抑制脂質過氧化等方面[15]。我國學者亦發現蝦青素對肝損傷具有保護作用，而且這種保護作用主要與增強氧化應激有關[16～18]。此外，我國學者對蝦青素在不同疾病中的作用進行了研究，不斷深究其藥理機制。曹秀明發現蝦青素對過氧化氫所致HepG2細胞線粒體氧化損傷具有明顯的保護作用[19]；蝦青素對骨關節炎軟骨細胞的氧化損傷，具有研發成為治療藥物的潛能[20]；蝦青素具有潛在的維持內皮功能的作用。上述蝦青素的藥理作用機制正是通過不同機制減輕氧化應激損傷的[15]。綜上所述，蝦青素對慢性肝損傷具有保護作用,該作用可能與蝦青素抗氧化有關。

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（收稿：2013-12-27）

（校對：陳從新）

Protective effect of astaxanthin on CCl4-induced chronic liver injury in rats

Huang Tiejun，Yu Qionghua，Dai Liejun Department of Infectious Diseases，School of Clinical Medicine，College of Science and Technology，Xianning 437100，Hubei Province，China

ObjectiveTo investigate the effects of astaxanthin on chronic liver injury in rats and to explore the underlying mechanism.MethodsChronic liver injury in rats were induced by carbon tetrachloride injection，and the rats were randomly divided into control，model and astaxanthin group.The content of ALT，AST，ALP，TP in serum andsuperoxide dismutase（SOD），glutathione-S-transfcrase（GST），glutathione（GSH）and malondialdehyd（MDA）in liver tissues were detected.The collagensⅠmRNA were detected by RT-PCR.ResultsThe collagens index in model group were（1.84±0.24），much higher than in control[（0.42±0.12），P＜0.05]，while the collagens index in astaxanthin group（0.89±0.12）decreased significantly（P＜0.05）as compared to that in the model; The collagenⅠmRNA in model group（0.48±0.06）was higher than in control group（0.12±0.02），while it decreased（0.35±0.09）in astaxanthin group（P＜0.01）as compared to that in the model；In control group，the MDA，GST，GSH and SOD in liver tissues were（1.93±0.76）nmol/mg，（18.43±5.34）U/mg，（75.45±9.67）mg/g and（678.80±76.56）U/mg，respectively.They were（6.56±1.09）nmol/mg，（54.34±7.65）U/mg，（35.45±9.01）mg/g and（203.89±89.00 U/mg），respectively.After treatment of astaxanthin，they were（3.34±1.12）nmol/mg，（30.89±4.78）U/ mg，（56.78±7.78）mg/g and（432.34±92.56 U/mg），respectively.Conclusion Astaxanthin could attenuate chronic liver injury in rats by improving the anti-oxidative stress.

Chronic liver injury；Astaxanthin；Protective effect；Oxidative stress

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.02.018

437100湖北省咸寧市湖北科技學院臨床醫學院傳染病學教研室

黃鐵軍，男，35歲，講師。E-mail：277872390@qq.com