芝麻餅粕蛋白質的理化和功能性質研究

王振斌 王 璽 馬海樂 林曉明 王 林 王 干 白志杰

（江蘇大學食品與生物工程學院，鎮江 212013）

芝麻餅粕蛋白質是一種營養價值較高的完全蛋白質資源。蛋白質的功能性質與蛋白質分子質量大小、結構特征、氨基酸組成、帶電情況等理化性質直接相關［1-4］，還與加工條件及pH、溫度、離子強度等外部環境等因素密切相關［1-2］。充分掌握蛋白質的功能特性，對于蛋白質在食品工業中的應用，以及進行新型蛋白質食品的開發具有重要意義。國內外對于芝麻蛋白質理化和功能性質的已有研究指出芝麻蛋白是食品工業潛在的原材料［5-7］。芝麻蛋白提取方法較多，其中堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法具有廣闊的產業化前景。提取方法對蛋白質的物理和功能性質具有顯著的影響，針對提取技術對芝麻蛋白理化和功能性質的對比研究目前鮮見報道。

本試驗以堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法3種不同工藝制備的芝麻餅粕蛋白質產品為原料，對其理化性質和功能性質進行對比研究，以期為芝麻餅粕蛋白質的工業化提取技術的選擇提供理論依據，并推動芝麻蛋白在食品工業上的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芝麻餅粕蛋白質：自制；芝麻餅粕：新沂吉順昌油脂科技有限公司；標準蛋白質：美國Sigma公司；大豆色拉油：市售；分析純試劑：氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，國藥集團化學試劑公司。

pH5-3C型pH計：上海理達儀器廠；HH-A恒溫水浴攪拌鍋：江蘇金壇市中大儀器廠；SPF401F電子天平：奧豪斯國際貿易（上海）中國有限公司；TGL-16高速臺式冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；FJ200-S數顯高速分散均質機：上海標本模型廠；FD-1A-50冷凍干燥機：北京博醫康試驗儀器有限公司；FOSS 2100型凱氏定氮裝置：上海新嘉電子有限公司；AKTA Purifier 100蛋白質分離純化設備：美國 GE Healcare集團；Sykam S433D／S433氨基酸分析儀：上海仁特檢測儀器公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 芝麻餅粕蛋白質的制備

在預備試驗的基礎上，確定堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質PA的工藝條件為：NaOH濃度0.37 mol／L，提取溫度75.19℃，提取時間4.7 h，液料比25.19，提取次數1次，提取結束后離心過濾，所得上清液即為芝麻餅粕蛋白質提取液，以1mol／L鹽酸調上清液pH至4.0（芝麻餅粕蛋白質等電點）使蛋白質沉淀，靜止30 min后4 500 r／min離心20 min，棄上清，所得沉淀再加5倍體積70%乙醇，室溫浸泡30 min，離心，再加2次2倍體積去離子水洗滌，離心，下層蛋白質真空冷凍干燥即得芝麻餅粕蛋白質產品，產品中蛋白含量為58.76%；超聲輔助堿提法制備芝麻餅粕蛋白質PU的工藝條件為：超聲功率密度2.22 W／mL，超聲時間30 min，超聲溫度70℃，NaOH濃度0.33 mol／L，液料比50，提取結束后離心過濾，所得上清液即為芝麻蛋白質提取液，以1 mol／L鹽酸調上清液pH至4.0（芝麻餅粕蛋白質等電點）使蛋白質沉淀，靜止30 min后4 500 r／min離心20 min，棄上清，所得沉淀再加5倍體積70%乙醇，室溫浸泡30 min，離心，再加2次2倍體積去離子水洗滌，離心，下層蛋白質真空冷凍干燥即得芝麻餅粕蛋白質產品，產品中蛋白含量為60.23%；蛋白酶法制備芝麻餅粕蛋白質PE的工藝條件為：酶解時間45 min，pH 9，酶解溫度50℃，加酶量4 000 U／g，液料比20，反應過程中經常以1 mol／L NaOH調節反應體系pH值，反應結束后，100℃滅酶 15 min，冷卻后4 500 r／min離心20 min，下層沉淀再加5倍體積去離子水攪拌10 min后離心，合并3次上清液，真空濃縮、冷凍干燥即得芝麻餅粕蛋白質產品，產品中蛋白質含量為67.89%。

1.2.2 氨基酸分析

精確稱取一定量樣品置于水解管中，加入6 mol／L的 HCI溶液，真空封口，在110℃下水解24 h，冷卻后定容、過濾、蒸干，取濾液1 mL于小燒杯中，真空干燥后加入1 moL 0.02 mol／L HCL溶液，在空氣中放置30 min后，采用氨基酸自動分析儀測定氨基酸的含量（色氨酸除外）。

1.2.3 相對分子量的測定

采用AKTA Purifier 100蛋白質分離純化設備進行檢測，凝膠柱類型及規格為Superose1 210／300 GL（10 mm×300 mm）預裝柱，檢測波長為UV 215 nm，洗脫液為50 mmol／L pH 7.0磷酸鹽緩沖液（含0.15 mol／L NaCl），上樣體積為 500μL，洗脫流速 0.5 mL／min。分子量標品為牛血清白蛋白質（分子質量MW 67 000 u）、細胞色素（MW 12 700 u）、鈷胺酰胺（VB12，MW 1 355 u）、Gly-Gly-Tyr-Arg（MW 451.48 u）。以標準蛋白質的相對分子質量對數（lg-MW）為橫坐標（X），洗脫時間為縱坐標（Y）作線性回歸分析，得到線性回歸方程Y＝-4.094X＋30.66，相關系數R2＝0.990 4。

1.2.4 溶解性的測定

參照 Klompong法［8］。準確稱取0.20 g樣品溶于20 mL水中，分別調節至相應pH，室溫攪拌30 min，4 500 r／min離心20 min后取上清液，用半微量凱氏定氮法［9］分別測定上清液和未處理樣品中的含氮量，氮溶解指數（Nitrigon Solmion Index，NSI）計算公式為：

1.2.5 持水性和持油性的測定

參照Khalid法［10］。稱取0.50 g蛋白質樣品置于10 mL的預先干燥并稱好質量的離心管中，加入5 mL去離子水（大豆油），充分振蕩、混勻后，置于40℃水浴中保溫30 min，4 000 r／min離心30min，傾去上層未吸附的水（大豆油），稱重，按照式（2）計算每克蛋白質樣品的持水性（持油性）。

式中：W0為蛋白質樣品的質量／g；W1為離心管加干燥樣品的總質量／g；W2為離心后離心管加沉淀的總質量／g。

1.2.6 乳化性及乳化穩定性的測定

參照Klompong法［8］。稱取一定量樣品溶解于不同pH緩沖液中配成1.0%的蛋白質溶液，室溫攪拌30 min后，加入5.0 mL大豆油，以10 000 r／min均質60 s，立即從底部吸取100μL乳濁液與10.0 mL 0.1%SDS溶液混勻，500 nm處測定光吸收值A0，此值即為乳化活性（EA）。10 min后重新從靜置的乳濁液底部取樣測定光吸收值At。乳化穩定性（ES）用乳化穩定指數（ESI）表示：

式中：At為10 min時刻的吸光值；A0為0時刻的吸光值；Δt為3次測定乳化活性的時間間隔，本試驗中該值為10 min。令 K＝At／A0，則當 ΔT為定值時，K與ESI成正比關系。為了避免計算時出現ΔA為0或負值，引進吸光值比（K）來描述乳化穩定性。

1.2.7 起泡性及起泡穩定性的測定

參照Rhicha法［11］。稱取一定量樣品溶解于pH 7緩沖液中配成1.0%的蛋白質溶液，室溫攪拌30 min后，然后用數顯高速分散機以10 000 r／min攪打60 s，立即全部轉移至 50 mL量筒內，測定此時（0 min）泡沫的體積（V1）并代表起泡性FC。

讀取室溫靜止放置30 min后量筒中泡沫體積（V2），則起泡穩定性FS計算公式為：

1.3 數據處理

采用SPSS軟件分析，試驗結果用“平均值±標準偏差”表示。P＜0.05為差異顯著水平，P＜0.01為差異極顯著水平。

2 結果與分析

2.1 芝麻餅粕蛋白質的氨基酸組成分析

堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質PA、PU和PE的氨基酸組成及必需氨基酸含量見表1。從表1可以看出，3種工藝制備的蛋白質氨基酸組成平衡，必需氨基酸含量豐富，谷氨酸、精氨酸和天門冬氨等非必需氨基酸含量均相對較高，而賴氨酸含量相對較少，這可能是因為芝麻餅粕在工業制油過程中，由于物理或化學操作所造成的。3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質的氨基酸組成存在一定差異，但差異較小，導致差異的原因可能與制備的方法不同有關。由表2數據還可以看出，從親水性氨基酸和疏水性氨基酸的比例來看，3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質均是親水性蛋白質，可以根據它們的氨基酸含量來判斷其功能性質。與FAO／WHO理想必需氨基酸模式相比3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質中除賴氨酸含量稍低外，其他必需氨基酸組成均接近或高于FAO／WHO模式，所以3種工藝制備的蛋白質均具有良好的營養價值。由于蛋白質的營養價值主要是由氨基酸尤其是必需氨基酸的含量和比例決定的，所以，3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質營養價值高，適宜于進一步加工制作食用蛋白質以作為營養食品或加工食品的配料，從而提高其應用價值［12-15］。

表1 3種芝麻餅粕蛋白質的氨基酸組成分析／g／100 g

2.2 芝麻餅粕蛋白質的相對分子質量分布

堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質PA、PU和PE的相對分子質量分布的吸收峰對應的相對分子質量與面積比如表2所示。表2可知，PA各組分相對分子質量5 000以上的芝麻餅粕蛋白質占總量的78.74%。PU各組分相對分子質量5 000以上的芝麻餅粕蛋白質占總量的74.87%。PA與PU的吸收峰的相對分子質量和分子量分布范圍百分比都比較接近，說明短時間的超聲波在加速蛋白質溶出的同時對蛋白質分子結構的破壞力比較小。PE各組分相對分子質量2 000以下的芝麻餅粕蛋白質占總量的73.8%。與PA及PU相比，PE中低分子質量肽鏈所占的比重較大。這是因為蛋白酶在一定的條件下對芝麻餅粕蛋白質長鏈的水解作用。

表2 3種芝麻餅粕蛋白質產品相對分子量分布比例

2.3 芝麻餅粕蛋白質的溶解性的比較

由圖1可知，在不同的pH值下，芝麻餅粕蛋白質溶解性不同，在等電點附近（pH 4）時NSI最低，溶解性差，而在偏離等電點的酸性和堿性條件下NSI較高。因為芝麻餅粕蛋白質分子是兩性分子，既能像酸一樣解離，又能像堿一樣解離。在酸性介質中，蛋白質分子主要以正離子狀態存在，電荷互相排斥，分子分散性好，溶解性較好。但是隨著pH值的升高，芝麻餅粕蛋白質的NSI就逐步下降，在等電點附近時，蛋白質以兩性離子狀態存在，NSI變得最低，當pH值繼續升高，蛋白質又變成負離子，NSI隨著pH值得升高而升高［12］。

圖1 pH對3種芝麻餅粕蛋白質的溶解性的影響

由圖1可知，在相同pH條件下3種方法制備的芝麻餅粕蛋白質的氮溶解指數存在明顯差異，特別是在酸性條件下。在等電點時，堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法制備的芝麻餅餅粕蛋白質的NSI分別為7%、40.23%和72.5%，三者差異極顯著。總體上：PE＞PU＞PA。超聲波輔助堿提可以提高蛋白質的溶解性，原因可能是超聲波處理使蛋白質結構疏松，親水性增強，同時超聲波處理能打斷蛋白質分子表面的自由氨基群與鄰近的羧基群之間的靜電引力，使蛋白質分子彼此分散，不易聚集，因而提高了蛋白質的溶解度［13-14］。蛋白酶法制備的芝麻餅粕蛋白質溶解性最好，這是由于蛋白酶對蛋白質的降解和改性，極性基團數目增加、多肽鏈平均分子量降低、蛋白質分子構象發生變化，從而使蛋白質親水性增強，有利于蛋白質在水中的溶解［15］。

2.4 芝麻餅粕蛋白質的持水性和持油性的比較

堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法制備的芝麻餅粕蛋白質的持水性分別為0.880 7、1.444 9、1.671 35 g／L；持油性分別為2.12、2.708 5、2.258 g／L。由圖2可知，3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質的持水性和持油性均有顯著性差異（P＜0.05），且PE＞PU＞PA。PU的持水性高于PA，這是因為超聲波的改性作用使蛋白質結構疏松，極性基團展開，能夠吸附大量的水分子［16-17］。與PA和PU相比，PE的持水性提高了15.68%。這主要是因為蛋白質分子被酶解后，大量親水基團外露的緣故。

圖2 3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質的持水性和持油性

在許多食品和生物體系中，蛋白質和脂類之間存在著相互作用，這作用是脂類的非極性脂肪族鏈和蛋白質的非極性鍵之間的疏水相互作用［16］。與PA相比，PU的持油性提高了，這是因為超聲波的改性作用使芝麻餅粕蛋白質結構疏松，疏水性氨基酸殘基數增加，能與脂類強烈的相互作用，形成脂質-蛋白質絡合物。而PE的持油性更高，可能是因為經蛋白酶水解，芝麻餅粕蛋白質鏈的高級結構被打開，使得疏水性氨基酸殘基數增加，持油性能提高［17-18］。

2.5 芝麻餅粕蛋白質的乳化性及乳化穩定性的比較

由圖3可知，芝麻餅粕蛋白質在等電點附近（pH 4）時乳化性最差，而在偏離等電點的酸性和堿性條件下乳化性較好。芝麻餅粕蛋白質的pH-乳化性曲線與pH-溶解性曲線相似，可能都是由蛋白質分子表面的結構和帶電荷性決定的。

圖3 3種芝麻餅粕蛋白質的乳化性隨pH的變化

PU與PA的乳化性差異較小，而PE的乳化性明顯優于PU和PA。蛋白酶解引起蛋白質乳化性發生改變，主要原因是芝麻餅粕經過蛋白酶的適度水解，使得蛋白質的溶解度增大，有利于蛋白質在油／水界面擴散并定位，因此乳化性增強［19］。

K值與ESI成正相關，K值越大，則ESI越大。由圖4可知，在pH＜6范圍內，PU比PA的乳化穩定性好，在pH＞6范圍內則剛好相反。在不同的pH條件下，PE的乳化穩定性差異較小，但高于PU和PA。蛋白酶的水解作用使得疏水基團暴露于分子表面，有利于蛋白質分子在油水界面上的有序排列，提高乳濁液的穩定性［20-21］。

圖4 3種芝麻餅粕蛋白質的乳化穩定性隨pH的變化

2.6 芝麻餅粕蛋白質的起泡性及起泡穩定性的比較

由圖5可知，3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質的起泡性及起泡穩定性均有顯著性差異（P＜0.05），且PE＞PU＞PA。PU的起泡性及泡沫穩定性優于PA，這是因為超聲處理使得芝麻餅粕蛋白的極性基團展開，有利于形成蛋白質薄膜，使水的表面張力迅速降低，提高起泡性和起泡穩定性［16，22］。

圖5 3種芝麻餅粕蛋白質的起泡性及起泡穩定性

與PU相比，PE的起泡性與泡沫穩定性分別提高了25%和11.07%。蛋白質的起泡性及起泡穩定性與溶解性密切相關，蛋白酶水解后蛋白質溶解性提高，緊密的蛋白質分子變松散，疏水性氨基酸側鏈暴露，使蛋白質快速定位至泡沫表面，提高蛋白質的起泡性及起泡穩定性；同時有利于多肽鏈的交聯，形成一定的黏層，提高蛋白質起泡穩定性［21，23］。

3 結論

3.1 堿溶酸沉法、超聲輔助堿提法和蛋白酶法3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質PA、PU和PE的氨基酸組成存在一定差異，但差異較小，且均含有豐富的必需氨基酸，谷氨酸、精氨酸等非必需氨基酸含量也均較高。3種工藝制備的芝麻餅粕蛋白質中除賴氨酸含量稍低外，其他必需氨基酸組成均接近或高于FAO／WHO模式，所以3種工藝制備的蛋白質均具有良好的營養價值。

3.2 堿溶酸沉法制備的芝麻餅粕蛋白質的相對分子質量為 11 789、9 990、4 981、2 975、1 963、1 005、1 901和 94，分別占總量的 49.90%、28.84%、6.23%、2.73%、2.73%、1.97%、2.79%、4.79%；超聲輔助堿提法制備的芝麻餅粕蛋白質的相對分子質量為 11 878、9 990、4 981、2 975、1 963、1 005、190和92，分別占總量的48.59%、26.28%、6.19%、2.92%、3.06%、2.39%、3.6%、6.97%；而蛋白酶法制備的芝麻餅粕蛋白質吸收峰相對分子質量為9 999、4 985、2 978、1 965、1 295、678、250和 177，分別占總量的1.65%、9.5%、8.23%、6.78%、11.98%、17.42%、25.59%、18.84%。

3.3 PA、PU和PE溶解性順序為：PE＞PU＞PA，三者均在等電點（pH 4）時最低，分別為7%、40.23%和72.5%。

3.4 PA、PU和PE的持水性、持油性、起泡性及起泡穩定性均有顯著性差異，且PE＞PU＞PA。與PU相比，PE的持水性和持油性分別提高了15.68% 和20.31%，起泡性與起泡穩定性分別提高了25%和11.07%。

3.5 蛋白質的pH-乳化性曲線與pH-溶解性曲線相似，乳化性和溶解性均為等電點最低，偏離等電點的酸性和堿性條件下較高。與PU相比，PE的乳化性及乳化穩定性均有一定程度的提高。在pH＜6范圍內，PU的乳化穩定性比PA的乳化穩定性好，而在pH＞6范圍內則相反；PE的乳化穩定性最好。

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