黑小麥麩皮酚酸物質的定性分析與阿魏酸含量測定

孫元琳 崔 璨 顧小紅 陳尚衛 宋 昱 張隴清

（運城學院生命科學系1，運城 044000）

（山西大學生命科學學院2，太原 030006）

（江南大學食品科學與技術國家重點實驗室3，無錫 214122）

（山西省農科院棉花研究所4，運城 044000）

酚酸（phenolic acid）屬于酚類化合物，多為苯甲酸和肉桂酸的羥化衍生物，主要有阿魏酸、芥子酸、香豆酸和咖啡酸等［1］。酚酸在植物中主要以游離態和結合態存在。近年來，酚酸作為抵抗癌癥和心臟病的潛在保護因子，受到越來越多的關注，其部分原因在于它們潛在的抗氧化活性、抗癌以及對慢性疾病的保健功效［2］。

全谷物攝入對慢性疾病的預防作用主要歸功于膳食纖維及其與之共價連接的酚酸類物質，被稱為“膳食纖維-酚類抗氧化劑復合物”，這個觀點已被廣泛接受［3］。阿魏酸（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸）是谷物中含量最豐富的酚酸類物質，主要以結合態存在［4］。研究表明，阿魏酸具有很強的抗氧化活性，并能調節人體免疫功能，通過抑制脂質氧化、降低血清中膽固醇含量和抗血栓作用預防動脈粥樣硬化和冠心病［5-8］。

黑小麥是一種珍貴的黑籽粒小麥品種，屬于優質特色谷物資源。與普通小麥相比，黑小麥含有更為豐富的膳食纖維、酚酸、花色苷、B族維生素和微量元素等生物活性物質，以其特殊的營養價值而備受關注［9-10］。近年來，國內已經培育出多個優良品種，如河東烏麥526、黑小麥76、亞洲1號、秦黑1號和紫晶1號等。但是，針對黑小麥生物活性物質的鑒定和功能性評價的研究力度還遠遠不夠。國內外科研人員對小麥、黑麥、大麥、玉米、稻谷等谷物中阿魏酸的含量和功能性展開了較為系統的研究［11-13］，對于黑小麥酚酸物質的組成和生物活性研究，國內外鮮見報道。以黑小麥為原料開發阿魏酸及其與之相結合的膳食纖維作為天然保健食品功能因子，對改善人類膳食結構、預防慢性代謝性疾病有著極其重要的意義。

Rondini等［14］報道，膳食中的結合態阿魏酸在腸道以相對較低的濃度被緩慢而持續的吸收，其效果比攝入游離態阿魏酸具有更好的生物利用率。本試驗以黑小麥麩皮為原料，對提取的游離態和結合態酚酸進行定性分析，并對結合態阿魏酸含量進行測定，為黑小麥特色谷物資源的有效增值和綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑小麥（紫粒“河東烏麥528”、藍粒“河東烏麥526”）和普通小麥（運旱22-33）麩皮：山西省農科院棉花研究所提供；阿魏酸：Sigma公司。乙醇、乙醚、甲醇和氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器

WATERSMALDISYNAPTQ-TOFMS四極桿飛行時間串聯質譜：美國Waters公司；Agilent 1100高效液相色譜儀：美國Agilent公司；756MC型紫外可見光分光光度計：上海精科分析儀器廠；KQ4200DE型數控超聲波清洗器：昆山超聲儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 游離態酚酸FPA的提取

將原料粉碎，過40目篩，稱取3 g原料放入150 mL具塞三角瓶中，加入75 mL 80%乙醇超聲避光提取15 min，然后在40℃水浴振蕩器振蕩提取3 h，離心（3 000 r／min，20min），上清液用 HCl溶液調 pH＝2，真空濃縮，乙醚萃取，N2揮干萃取液中的乙醚后，用1 mL甲醇復溶，得到游離態酚酸樣品FPA［15］。

1.3.2 結合態酚酸CPA的提取

提取液離心后的殘渣加入60 mL 2 mol／L NaOH溶液，充N2在40℃水浴振蕩條件下避光提取12 h，離心（3 000 r／min，20 min），上清液用 HCl溶液調pH＝2，真空濃縮，乙醚萃取，N2揮干萃取液中的乙醚后，用1 mL甲醇復溶，得到結合態酚酸樣品CPA［16］。

1.3.3 酚酸樣品的定性分析

紫外（UV）光譜分析：取適量標準阿魏酸以及制備好的游離態和結合態酚酸樣品分別用甲醇溶解，配制成1 mg／mL溶液進行紫外吸收光譜掃描，掃描波長為200～400 nm。

LC／MS分析：色譜條件 Lichrospher C18柱（5 μm，2.1 mm ×250 mm）；流動相為體積分數10%的乙腈-0.1%的甲酸；梯度洗脫：0～20 min 100% →80%，20～30 min 80%→40%；柱溫30℃；流速0.3 mL／min；檢測波長為325 nm；進樣量5μL。

質譜條件：離子源：EIS源；源電壓3.88 kV；錐孔電壓25 V；離子源溫度120℃；脫溶劑氣溫度300℃；質量范圍：200～1 000 m／z；光電倍增器電壓700 V；載氣流速4.2 L／h。液質聯用結果用 Masslynx V3.1（2）軟件分析。

1.3.4 阿魏酸含量測定

采用HPLC方法。色譜條件：Symmetry C18柱（5μm，3.9 mm ×150 mm）；流動相為乙腈∶水 ＝15∶85；流速 0.8 mL／min；等梯度洗脫；檢測波長為325 nm；柱溫30℃；進樣量5μL。

標準曲線制作：精密稱取阿魏酸標準品10 mg，用甲醇定容至50 mL容量瓶中，配成0.2 mg／mL的標準溶液。分別吸取1、5、10、12、15μL標準溶液進樣液相色譜儀。以進樣量對色譜峰面積作圖得標準曲線方程。標準曲線為方程 Y＝70.118X-34.095，R2＝0.999。將樣品與標準阿魏酸的相對保留時間進行對照，并測定阿魏酸含量。每個樣品測定3次。

2 結果與分析

2.1 酚酸樣品的紫外光譜（UV）分析

將阿魏酸標準品、游離態和結合態酚酸樣品進行紫外掃描，紫外吸收光譜如圖1所示。紫外光譜顯示，樣品在286 nm和325 nm處較強的吸收峰為酚酸分子中苯環的特征吸收。210～250 nm出現的強吸收帶，也表明分子骨架具有環狀共軛雙鍵體系。經比較，2個樣品與阿魏酸標準品的吸收特征峰相似，表明游離態和結合態酚酸具有與阿魏酸相似的分子結構。

圖1 游離態酚酸FPA（A）和結合態酚酸CPA（B）的紫外吸收光譜

2.2 游離態酚酸FPA的定性分析

LC／MS是以HPLC為分離手段，以MS為鑒定方法的分離分析方法。液相色譜和串聯質譜的結合，實現了樣品的分離和鑒定，是對未知物質定性分析的強有力工具。圖2為游離態酚酸樣品的LC／MS總離子流圖及其主峰所對應的一級質譜圖。圖2a顯示，游離態酚酸樣品FPA被分離為2個主要組分A和B，保留時間分別為3.83 min和4.17 min。組分A和B的ESI-MS圖譜均顯示相同的負離子峰m／z：223.1［M-1］-，可以判斷，2種游離態酚酸物質為一對同分異構體，且相對分子質量為224。

圖2 游離態酚酸FPA的LC／MS總離子流圖和峰A、峰B的MS圖

圖3是在一級質譜圖的基礎上對粒子進行轟擊得到的LC／MS／MS總離子流圖及其主峰所對應的二級串聯質譜圖。在ESI-MS／MS條件下，母離子m／z 223.1（［M-1］-）經裂解后，發生鍵的斷裂，生成的碎片離子主要有 m／z 193.1（［M-1］-）、178、149、134，歸屬為阿魏酸，相對分子質量為194。碎片離子m／z193.1相對于母離子m／z223.1丟失了2個CH3（m／z 15）。由此，可以確定游離態酚酸FPA為芥子酸，相對分子質量為224。

圖3 游離態酚酸FPA的LC／MS／MS總離子流圖和峰 A、峰 B的 MS／MS圖

2.3 結合態酚酸CPA的定性分析

圖4為結合態酚酸樣品的LC／MS總離子流圖及其所對應的一級質譜圖。圖4c顯示，結合態酚酸樣品CPA被分離為2個主要組分A和組分B，保留時間分別為3.76min和4.13min。組分A和組分B的ESI-MS圖譜均顯示相同的負離子峰，m／z 193.1［M-1］-。準分子離子 m／z 193.1［M-1］-經裂解后，發生鍵的斷裂，丟失了 CH3（m／z 15）、COOH（m／z 44）等基團，生成的碎片離子主要有 m／z 178、149、134，歸屬為阿魏酸，從而可以判斷2種酚酸組分為一對同分異構體。由此，可以確定結合態酚酸CPA主要為阿魏酸，相對分子質量為194。

圖4 結合態酚酸CPA的LC／MS總離子流圖和峰A、峰B的MS圖

2.4 阿魏酸含量測定

采用HPLC對紫粒和藍粒黑小麥麩皮中的結合態阿魏酸含量進行測定。阿魏酸標準品和樣品的HPLC圖譜見圖5。阿魏酸標準樣品的出峰保留時間為10.509 min，樣品的最大吸收峰保留時間與阿魏酸標準品吸收峰保留時間吻合。對應出峰時間，根據峰面積計算結合態阿魏酸含量，結果如表1所示。

圖5 黑小麥麩皮結合態阿魏酸的HPLC圖譜

由表1可知，紫粒黑小麥麩皮的結合態阿魏酸含量為2.07 mg／g，與藍粒黑小麥麩皮含量（2.12 mg／g）相近，其含量高于當地種植的普通小麥麩皮的阿魏酸含量（1.17 mg／g）。

表1 黑小麥麩皮結合態阿魏酸含量

3 結論

對紫粒、藍粒黑小麥麩皮中的游離態和結合態酚酸進行制備。通過紫外光譜判斷2種酚酸物質具有與阿魏酸相似的分子結構。采用LC／MS對酚酸樣品進行定性檢測，結果顯示，游離態和結合態酚酸的相對分子質量分別為224和194，由此判斷，黑小麥麩皮中的游離態酚酸FPA主要為芥子酸，結合態酚酸CPA主要為阿魏酸。

采用HPLC對紫粒、藍粒黑小麥麩皮中的結合態阿魏酸含量進行測定。結果表明，紫粒黑小麥麩皮的阿魏酸含量為2.07 mg／g，與藍粒黑小麥麩皮的阿魏酸含量（2.12 mg／g）相近，其含量高于當地種植的普通小麥麩皮的阿魏酸含量（1.17 mg／g）。

［1］Robbins R.Phenolic acid in foods：an overview of analytical methodology［J］.Journalof Agricultural and Food chemistry，2003，51：2866-2887

［2］Kyung-Hee Kim，Rong Tsao，Raymond Yang，et al.Phenolic acid profiles and antioxidant activity ofwheat bran extrracts and the effect of hydrolysis condition［J］.Food Chemistry，2006，95：466-473

［3］Vitaglione Paola，Napolitano Aurora，Fogliano Vincenzo.Cereal dietary fibre：a natural functional ingredient to deliver phenolic compounds into the gut［J］.Trends in Food Science&Technology，2008，19：451-463

［4］Verma B，Hucl P，Chibbar R N.Phenolic acid composition and antioxidant capacity of acid and alkali hydrolysed wheat bran fractions［J］.Food Chemistry.2009，116：947-954

［5］Liyana-Pathirana C M，Shahidi F.Importance of insoluble-bound phenolics to antioxidant properties of wheat［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（4）：1256-1264

［6］李全宏，陶國琴，付才力，等.麥麩中生理活性物質研究與應用進展［J］.食品科學，2004，25（8）：196-199

［7］歐仕益.阿魏酸的功能和應用［J］.廣州食品工業科技，2002，18（4）：50-53

［8］鄭學玲，姚惠源，李利民，等.小麥加工副產品-麥麩的綜合利用研究［J］.糧食與飼料工業，2001，（12）：38-39

［9］孫善澄，劉少翔.黑粒高營養小麥種植與加工利用［M］.北京：金盾出版社，2003

［10］LiWende，Beta Trust，Sun Shancheng，et al.Protein characteristics of Chinese black-grained wheat［J］.Food Chemistry，2006，98：463-472

［11］Rosa Natalia N，Dufour Claire，Lullien-Pellerin Valérie，et al.Exposure or release of ferulic acid from wheat aleurone：Impact on its antioxidant capacity［J］.Food Chemistry.2013，141（3）：2355-2362

［12］Ndolo V U，Beta T，Fulcher R G.Ferulic acid fluorescence intensity profiles and concentration measured by HPLC in pigmented and non-pigmented cereals［J］.Food Research International.2013，52（1）：109-118

［13］Buranov Anvar U，Mazza G.Extraction and purification of ferulic acid from flax shives，wheat and corn bran by alkaline hydrolysis and pressurised solvents［J］.Food Chemistry，2009，115（4）：1542-1548

［14］Rondini L，Peyrat-Maillard M N，Marsset-Baglieri A，et al.Bound ferulic acid from bran is more bioavailable than the free compound in rat［J］.Journal of Agricultural and Food chemistry，2004，52：4338-4343

［15］江萍，徐貴華.15種柑橘果皮酚酸的含量測定［J］.食品與發酵工業.2008，34（6）：3-7

［16］WeiweiGuo，Trust Beta.Phenolic acid composition and antioxidant potential of insoluble and soluble dietary fibre extracts derived from select whole-grain cereals［J］.Food Research International，2013，51（2）：518-525.