進(jìn)口玉米酒糟粕中15種真菌毒素的檢測和風(fēng)險分析

楊振宇 俞天樂 周 瑤 張浩平 馮 晶

（上海出入境檢驗檢疫局，上海 200131）

含可溶物干玉米酒糟（Distillers Dried Grainswith Solubles，以下簡稱DDGS）主要指現(xiàn)代化燃料酒精工廠，干法生產(chǎn)燃料酒精過程中，用玉米子實與精選酵母混合發(fā)酵生產(chǎn)酒精和二氧化碳后，剩余的發(fā)酵殘留物通過低溫干燥形成的一種共生產(chǎn)品［1］，可作為牲畜和家禽日糧的組分［2］。然而，由于真菌霉素污染等問題，DDGS的使用一直受到限制。玉米中可能存在多種真菌毒素，包括黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、伏馬菌素、T-2毒素和玉米赤霉烯酮（ZON）等。這些毒素大多在收獲之前生成于玉米中。由玉米制成的DDGS水分含量高，霉菌容易生長，也會造成真菌霉素含量增高［3-4］。此外，DDGS生產(chǎn)過程不但不會去除真菌毒素，而且會濃縮富集，導(dǎo)致DDGS中真菌霉素的含量為原料玉米中的3倍［5］。

飼喂含有真菌毒素的飼料會導(dǎo)致家畜免疫力低下、病患率升高，生產(chǎn)性能下降［6］。所以世界各國，包括中國都制定了飼料中一部分真菌毒素的限量［7-10］。國標(biāo)中沒有針對DDGS的限量要求，目前僅有對玉米的限量：黃曲霉毒素B1≤50μg／kg、赭曲霉毒素A≤100μg／kg和玉米赤霉烯酮≤500μg／kg。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2只有配合飼料的限量（最嚴(yán)格為 1 mg／kg）。

真菌毒素的檢測方法很多，主要有薄層色譜法［10-14］、酶聯(lián)免疫法［13-17］、液相色譜法［18-21］等。國標(biāo)規(guī)定的部分真菌毒素的檢測方法也都采用了這3種方法。但是，這些方法存在著一定缺陷。如薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法只是半定量方法，液相色譜法定量較為準(zhǔn)確，但定性能力不足，而且這些方法都只能檢測某一種或者某一類最多4種真菌毒素。液相串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MSMS）技術(shù)大大增強了定性定量能力，在真菌毒素分析方面成為目前最先進(jìn)的分析技術(shù)［22-24］。本試驗以液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時檢測DDGS中15種真菌毒素。該方法只需1次凈化，過程簡單快速，定性定量準(zhǔn)確。使用該方法對入境的DDGS樣品進(jìn)行檢測，通過對結(jié)果分析并進(jìn)行分布擬合，首次提出了入境DDGS中真菌毒素的風(fēng)險評價結(jié)論。

1 材料與方法

1.1 試劑

水：密理博純水機(jī)生產(chǎn)的一級水；甲醇、乙腈、甲酸、醋酸銨（色譜純）：國藥集團(tuán)；真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品黃曲霉毒素 B1（AFT B1）、B2（AFT B2）、G1（AFT G1）、G2（AFT G2）、雜色曲霉毒素（ST）、玉米赤霉烯酮（ZON）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素DON）、雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-AcDON）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-Ac-DON）、鐮刀菌烯酮（FX）、二醋酸熏草鐮刀菌烯醇（DAS）、新茄病鐮刀菌烯醇（NEO）、T-2毒素（T-2）、毒素（HT-2）：奧地利 biopure公司，用乙腈配制成10 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 儀器和設(shè)備

TSQQuantum Ultra液相串聯(lián)質(zhì)譜儀：配ACCELA液相色譜，Thermo fisher公司；Allegla X-22R高速離心機(jī)：Beckman Coulter公司；PT2100均質(zhì)儀：Poly TRO公司；QGC-12T氮吹儀：泉島公司；890／H超聲儀：Elma公司；Myco 226多功能凈化柱：ROMER公司；0.22μm有機(jī)相針式濾膜：CNW公司。

1.3 前處理試驗方法

準(zhǔn)確稱取DDGS樣品5 g左右到50 mL塑料離心管中，加入25 mL乙腈水溶液（86∶14），用均質(zhì)儀在20 000 r／min下均質(zhì)1 min，然后超聲提取30 min，在4 000 r／min轉(zhuǎn)速下離心5 min，收集上清液。加25 mL乙腈∶水（1∶1）到殘存固體中，在渦旋振蕩器上振蕩使固體均勻分散，然后超聲30 min，在4 000 r／min轉(zhuǎn)速下離心5 min。合并2次上清液至50 mL離心管中，加入乙腈至50 mL。混勻。

吸取10 mL上清液過Myco 226多功能凈化柱，準(zhǔn)確吸取過柱的凈化液5 mL，在60℃水浴氮吹至近干。然后用1 mL甲醇醋酸銨水溶液（甲醇：10 mmol醋酸銨水溶液為1∶1）溶解，過膜至進(jìn)樣瓶中，用LCMSMS測量，外標(biāo)法定量，結(jié)果需經(jīng)回收率校正。

1.4 儀器試驗方法

儀器檢測分2次。1次為正離子模式，檢測AFT B1、AFT B2、AFT G1、AFT G2、ST、DAS、NEO、T-2、HT-2；1次為負(fù)離子模式，檢測 ZON、DON、NIV、3-AcDON、15-AcDON、FX。色譜柱采用 Thermo公司Hypersil GOLD C18（50 mm×2.1 mm×1.9μm）PFP色譜柱；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL；流動相甲醇水梯度洗脫。離子設(shè)置見表1。AFT B1、B2、G1、G2的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍均為0～4μg／L；DAS的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0～10μg／L；T-2、HT-2、ST、NEO的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0～20μg／L；ZON的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍均為0～100 μg／L；DON、FX、NIV、3-AcDON、15-AcDON的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0～1 000μg／L。

表1 15種真菌毒素的性質(zhì)

2 結(jié)果與分析

2.1 方法指標(biāo)及驗證

由于不同的真菌毒素在質(zhì)譜上形成離子的情況不同，而且離子化試劑、流動相分離效果也不同。本研究將真菌毒素分成正負(fù)2類來檢測，這2類毒素在質(zhì)譜上的檢測參數(shù)都不完全相同，分組詳見1.4節(jié)。15種真菌毒素色譜圖見圖1、圖2。

圖1 正離子模式的色譜圖

圖2 負(fù)離子模式的色譜圖

本研究對方法進(jìn)行了驗證。15種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都在0.99以上，線性良好。

根據(jù)精密度、色譜圖干擾情況等方面的綜合考慮，15種真菌毒素的定量檢出限（LOQ）估計值見表2。

表2 15種真菌毒素的定量檢出限／μg／kg

本研究通過對真菌毒素含量較低的DDGS樣品進(jìn)行加入已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品以驗證方法的回收率和精密度（n＝6）結(jié)果見表3～表6。

表3 AFTB1、AFTB2、AFTG1和 AFTG2的添加回收和精密度結(jié)果／%

表4 T-2、HT-2、ZON和ST的添加回收和精密度結(jié)果／%

表5 NEO、DAS和FX的添加回收和精密度結(jié)果／%

表6 DON、NIV、3-AcDON和15-AcDON的添加回收和精密度結(jié)果／%

由表3～表6可以看到，不同真菌毒素的回收率并不相同，但是相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。造成部分真菌毒素回收率較低的原因可能是過柱造成的回收率損失；液質(zhì)的基質(zhì)抑制效應(yīng)。相對偏差較小說明方法具有較好的重現(xiàn)性，所以可以采取回收率校正的方式定量。本研究采用的15個真菌毒素的數(shù)據(jù)均是對實際檢測值用平均回收率校正后的結(jié)果。

本研究還對2種有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CRM）進(jìn)行了檢測。每個樣品檢測3次，檢測結(jié)果見表7。

表7 有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測結(jié)果／μg／kg

從表7可以看到，結(jié)果均在有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)稱值之內(nèi)，說明本方法準(zhǔn)確度可靠。

2.2 檢測結(jié)果

本研究抽取了從上海進(jìn)口的67件DDGS樣品，按照本研究建立的檢測方法進(jìn)行檢測。AFTB2、AFT G1、AFTG2、DAS、NEO、FX、NIV、3-AcDON、15-AcDON結(jié)果均小于檢出限，而AFTB1有16個樣品有檢出，均小于5μg／kg，離限量50μg／kg比較遠(yuǎn)；ST有17個樣品有檢出，均小于4μg／kg，這些數(shù)據(jù)結(jié)果不再討論。所有樣品的DON、ZON、T-2、HT-2都有檢出，統(tǒng)計結(jié)果見表8。由于T-2、HT-2屬于一類毒素，同時統(tǒng)計了T-2類總量。

2.3 T-2、HT-2毒素的含量結(jié)果分析

表8的數(shù)據(jù)中，T-2類毒素的總量是由T-2和HT-2的含量加和得到。可以看出，T-2、HT-2大概成線性關(guān)系，擬合直線圖見圖3。其線性方程為Y（HT-2）＝0.966＋1.652X（T2），相關(guān)系數(shù)為0.980。

表8 T-2、HT-2、ST、DON、ZON含量統(tǒng)計結(jié)果

圖3 T-2和HT-2的線性擬合圖

可以看到，T-2、HT-2含量之間的相關(guān)性非常好，兩者的比例大約是 8（HT-2）：5（T-2）。其中HT-2占到了62%。

另外，本研究還使用＠Risk ver 5.7軟件模擬了T-2類總量的分布，得到的圖形和擬合曲線見圖4。

圖4 T-2類總量的擬合分布

從圖4可以看到，DDGS中T-2類總量可以用Person 5分布來模擬。通過模擬的分布曲線，也可以得到目前上海口岸進(jìn)口的DDGS的T-2和HT-2有95%可能性不會超過75μg／kg；99%可能性不會超過185μg／kg。

2.4 DON、ZON毒素的含量結(jié)果分析

表8的數(shù)據(jù)說明了DON、ZON均有檢出。其中DON和ZON也有一定的正相關(guān)關(guān)系。具體擬合直線見圖 5。其線性方程為 Y（DON）＝-16.34＋0.43X（ZON）相關(guān)系數(shù)為0.843。說明存在著高含量的DON，也存在著高含量的ZON，反之亦然。

圖5 DON和ZON的擬合直線

除了以上T-2類毒素以及DON和ZON之間存在著相關(guān)性以外，其他毒素之間的關(guān)系均未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性。由于DON主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生，二者也是產(chǎn)生ZON的菌種，所以二者同時出現(xiàn)的概率很大，本研究所得到二者的結(jié)果有一定的相關(guān)性，也是很自然的。

另外，類似于T-2類總量的處理，使用＠Risk ver 5.7軟件模擬了ZON和DON的分布，得到的圖形和擬合曲線分別見圖6和圖7。從圖6～圖7可以看到，DDGS中ZON和DON含量均可以用Invgauss分布來模擬。通過模擬的分布曲線進(jìn)行概率計算，可以得到目前上海口岸進(jìn)口的DDGS的ZON有95%可能性不會超過183μg／kg；99%可能性不會超過241μg／kg。DON含量有95%可能性不會超過406 μg／kg；99%可能性不會超過535μg／kg。

圖6 ZON的擬合分布

圖7 DON的擬合分布

從數(shù)據(jù)分析可以看到，DDGS中含有一定量的DON和ZON，參照飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，可以看到這2種真菌毒素99%的概率不會超過限量的一半。而T-2和HT-2的總量也不會超過配合飼料限量（1 mg／kg）的20%。

3 結(jié)論

本研究建立了液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測玉米酒糟粕中多種真菌毒素的檢測方法，采用乙腈水溶液提取，用Myco-226柱凈化，LC-MS-MS檢測。檢測的真菌毒素包括黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、雜色曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素）、雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、鐮刀菌烯酮、二醋酸熏草鐮刀菌烯醇、新茄病鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素等15種。方法均經(jīng)過優(yōu)化和驗證，定性定量準(zhǔn)確，滿足進(jìn)口玉米酒糟粕的檢測要求。

根據(jù)對67個進(jìn)口美國玉米酒糟粕樣品的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些樣品中玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素等真菌毒素均有檢出。本研究對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計分析，可以得到以下結(jié)論：T-2和HT-2含量相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.980；DON和ZON含量相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.843。另外，DON、ZON、T-2類超出限量的可能性不大。而這些毒素的協(xié)同作用造成的危害目前仍然是空白。總體而言，DDGS中存在著一定水平的真菌毒素含量，在作為飼料配料時要了解其含量水平，選用毒素含量低的DDGS，優(yōu)化配方，保證飼料的安全。

［1］DDGS飼料的定義［J］.飼料研究，2009（8）：76

［2］張樂樂，胡文婷，王寶維.玉米酒糟粕（DDGS）在動物營養(yǎng)中的研究進(jìn)展［J］.飼料廣角，2010（18）：37-39

［3］Zhang Y，Caupert J.Survey ofmycotoxins in U.S.distiller’s dried grains with solubles from 2009 to 2011［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60（2）：539-43

［4］Zhang Y，Caupert J，Imerman P M，et al.The occurrence and concentration of mycotoxins in U.S.distillers dried grains with solubles［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（20）：9828-37

［5］曹冬梅.美國DDGS及中國北方玉米中的霉菌毒素檢測［J］.飼料廣角，2010（24）：24-25

［6］Diaz D E，Whitlow L W，Hagler JR W M.Mycotoxins in feed［J］.Feedstuffs.2012，12（9）：76-88

［6］GB 13078—2001，飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］

［7］GB 13078.2—2006，飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 飼料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允許量［S］

［8］GB 13078.3—2007，配合飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的允許量［S］

［9］GB 21693—2008，配合飼料中T-2的允許量［S］

［10］GB／T 8381—2008，飼料中黃曲霉毒素B1的測定 半定量薄層色譜法［S］

［11］GB／T 8381.4—2005，配合飼料中T-2毒素的測定 薄層色譜法［S］

［12］GB／T 8381.6—2005，配合飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定薄層色譜法［S］

［13］GB／T 19539—2004，飼料中赭曲霉毒素 A的測定［S］

［14］GB／T 19540—2004，飼料中玉米赤酶烯酮的測定［S］

［15］GB／T 174180—2008，飼料中黃曲霉毒素B1的測定 酶聯(lián)免疫吸附法［S］

［16］馮翀.食品中真菌毒素檢測分析——以酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）為例［J］.中國科技博覽，2011（36）：264-265

［17］胡驍飛，職愛民，劉慶堂，等.真菌毒素ELISA檢測方法新進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（8）：100-103

［18］GB／T 28716—2012，飼料中玉米赤酶烯酮的測定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法［S］

［19］GB／T 28718—2012，飼料中T-2毒素的測定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法［S］

［20］GB／T 5009.209—2008，谷物中玉米赤霉烯酮的測定［S］

［21］GB／T 23502—2009，食品中赭曲霉毒素A的測定 免疫親和層析凈化高效液相色譜法［S］

［22］張曉飛，岳延濤，楊美華，等.色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在真菌毒素檢測中的研究進(jìn)展［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（12）：109-114

［23］Monbaliu S，Poucke CV，Detavernier C.Occurrence ofmycotoxins in feed as analyzed by a multi-mycotoxin LCMS／MS method［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（1）：66-71

［24］Jackson LC，Kudupoje M B，Yiannikouris A.Simultaneous multiple mycotoxin quantification in feed samples using three isotopically labeled internal standards applied for isotopic dilution and data normalization through ultra-performance liquid chromatography／electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2012，26（23）：2697-2713.