白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α對人正常髓核細胞基質金屬蛋白酶-28轉錄影響的研究

張偉軍，馮 虎，丁亞軍，鄧 斌，蔣允昌，章浩杰，夏 震

下腰痛是一種很常見的疾病，據統計超過一半的人，在一生中的某個階段都會出現下腰痛[1]，研究顯示基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases,MMPs)與椎間盤退變之間關系密切，是導致椎間盤退變的主要原因之一，MMPs是參與降解包括骨在內的全身各種組織細胞外基質的蛋白酶家族，包括基質中以及整合于質膜中的各種膠原酶和彈性蛋白酶等，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名[2]，基質金屬蛋白酶-28(matrix metalloproteinase-28,MMP-28)是MMPs的最新成員，最新研究發現其與髓核細胞退變密切相關，本實驗通過炎性介質白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激體外培養人體髓核細胞，采用實時聚合酶鏈反應(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)技術檢測髓核細胞MMP-28 mRNA轉錄水平，探討MMP-28的調控因素及炎性介質和MMP-28與髓核細胞退變之間的關系。

1 資料和方法

1.1 主要資料和試劑

人體髓核原代細胞株(美國Sciencell公司)，重組人IL-1β(美國Perprotech公司)，重組人TNF-α(美國Perprotech公司)，DNA Marker 1(北京天根公司)，Trizol法總RNA提取試劑盒(北京天根公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根公司)，PCR試劑盒(北京天根公司)，焦碳酸二乙酯 (diethy pyrocarbonate,DEPC，上海浩然公司)，溴化乙錠(ethidium bromide,ED)染料(北京天根公司)，瓊脂糖(Agarose，LMP，美國Promega公司)異丙醇(上?；瘜W試劑公司)，氯仿(上?；瘜W試劑公司)， 無水乙醇(上?；瘜W試劑總廠)，TBE電泳緩沖液(上海化學試劑公司)，胰蛋白酶(南通碧云天公司)引物(上海捷瑞生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞因子模型

髓核細胞培養至第2代，當達90%融合時，常規消化、離心、制成細胞懸液，用血球計數板計數后接種于六孔培養板中，每個孔內約有2.5×105個細胞?？瞻讓φ战M：不加任何致炎因子，只加培養基進行常規培養。實驗組：配制不同濃度的致炎因子加入培養孔內作為實驗組，即10 ng/mL IL-1β組、50 ng/mL IL-1β組、50 ng/mL TNF-α組、100 ng/mL TNF-α組。每個濃度組設立三復孔。每隔24 h更換空白對照組和實驗組培養基，實驗組細胞因子濃度保持不變。常規培養72 h。

1.2.2 髓核細胞RNA提取

吸去培養孔的上清，加入1 mL Trizol裂解液，收集至離心管，加入氯仿搖勻，離心后轉移水相至新的離心管，加入異丙醇，離心后棄上清，加入乙醇，振蕩混勻，離心后吸去上清后空氣中干燥5～10 min，加入30 μL DEPC水溶解RNA。計算RNA樣本的純度，達1.8后進行下一步。

1.2.3 RT-PCR反應

MMP-28及內參(β-肌動蛋白)引物見表1，RT-PCR步驟具體見試劑盒說明。

1.2.4 PCR產物觀察

取PCR產物3 μL加3 μL的DNA電泳上樣緩沖液上樣，同時取DNA Marker 6 μL上樣，電壓110 V，電流50 mA電泳30～40min，擴增得到相應的目的產物片段，用凝膠數字成像系統掃描分析擴增產物條帶，分別測定各擴增帶灰度值，以各自目的基因擴增帶灰度值與內參擴增帶的灰度值比，作為其mRNA水平的指標。

表1 MMP-28、β-肌動蛋白上下游引物序列Tab.1 MMP-28,β-actin upstream and downstream primer sequences

2 結 果

不同濃度的IL-β刺激人體髓核細胞(見表2，圖1)。各組數據均滿足正態性和方差齊性，采用單因素方差分析，F=1.253，P>0.05，各組間差異無統計學意義，未發現IL-1β影響人體正常髓核細胞MMP-28mRNA轉錄。

表2 IL-1β刺激人正常髓核細胞72 h后MMP-28 mRNA的轉錄水平Tab.2 MMP-28 mRNA transcriptional level in human nucleus pulposus cells after 72 h IL-1β stimulation

不同濃度的TNF-α刺激人體髓核細胞(見表3，圖2)。各組數據均滿足正態性和方差齊性，采用單因素方差分析，F=279.510，P<0.05，總體之間差異存在統計學意義，可進行組間比較：低濃度與空白對照組相比，P<0.01，差異有統計學意義；高濃度與低濃度組相比，P<0.01，差異有統計學意義，TNF-α對髓核細胞MMP-28 mRNA轉錄具有刺激作用，且高濃度上調作用更明顯。

a,b：空白對照組(0 ng/mL) c,d:低濃度組(10 ng/mL) e,f：高濃度組(50 ng/mL)
a,b：Control group (0 ng/mL) c,d: Low concentration group (10 ng/mL) e,f：High concentration group (50 ng/mL)
圖1 不同濃度的IL-1β刺激髓核細胞72 h后MMP-28 mRNA轉錄水平
Fig.1 MMP-28 mRNA transcriptional level in human nucleus pulposus cells after 72 h different IL-1β stimulation

表3 TNF-α刺激人正常髓核細胞72 h后MMP-28mRNA的轉錄水平Tab.3 MMP-28 mRNA transcriptional level in human nucleus pulposus cells after 72 h TNF-α stimulation

注： *與空白對照組相比，P<0.05；**與另2組比較，P<0.01
Note: *Compared with control group,P<0.05；**compared with other groups,P<0.01

3 討 論

MMP-28是MMPs的最新成員，MMP-28又名上皮水解素(epilysin),最初克隆自人的角質形成細胞、睪丸和混合性腫瘤cDNA文庫[3-4]。重組體MMP-28在體外實驗證實可以降解酪蛋白，一種非特異性、很多酶都可以水解的蛋白，然而在體內其作用底物仍不詳，Gruber等[5]首次報道發現MMP-28同樣存在于人體椎間盤組織，并認為MMP-28與人體椎間盤退變密切相關。

退變椎間盤組織內檢測到大量炎性因子，學者們就MMPs、炎性因子、椎間盤退變之間做了大量研究，Le Maitre等[6]研究發現IL-1表達量增加，可誘發椎間盤細胞基質降解酶如MMP-1、3、7、13和含凝血酶敏感素4型基序的解聚素樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4,ADAMTS-4)表達量增加，致使基質蛋白合成減少，降解增加，導致相應細胞生化特性改變，最終發生退變。Séguin等[7]研究發現，TNF-α可以下調蛋白聚糖和Ⅱ型膠原基因表達，減少蛋白聚糖和膠原的合成，并且還可以增加MMP-1，MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4及ADAMTS-5，從而降解椎間盤基質，由此可見TNF-α能夠促進椎間盤退變。

a,b：空白對照組(0 ng/mL) c,d:低濃度組(50 ng/mL) e,f：高濃度組(100 ng/mL)
a,b： Control group (0 ng/mL) c,d: Low concentration group (50 ng/mL) e,f：High concentration group (100 ng/mL)
圖2 不同濃度的TNF-α刺激髓核細胞72h后MMP-28 mRNA轉錄水平
Fig.2 MMP-28 mRNA transcriptional level in human nucleus pulposus cells after 72 h different TNF-α stimulation

然而關于炎性因子調控MMP-28的報道甚少，Saarialho-Kere等[8]報道TNF-α可以在體外誘導角質形成細胞MMP-28表達增加。本研究通過體外培養正常人體髓核細胞，用不同濃度的IL-1β(0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)和TNF-α(0 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL)刺激髓核細胞，72 h后檢測細胞中MMP-28 mRNA轉錄水平。IL-1β刺激72 h后發現低濃度組(0.343±0.018)、高濃度組(0.343±0.018)與空白對照組(0.325±0.019)之間差異無統計學意義(P>0.05)，未發現IL-1β對MMP-28 mRNA轉錄具有調控作用，但是低濃度TNF-α(50ng/mL)刺激后即發現MMP-28 mRNA轉錄水平(0.515±0.029)明顯上調(P<0.01)，隨著TNF-α濃度增加(100 ng/mL)MMP-28 mRNA轉錄水平(0.610±0.012)繼續上調(P<0.01)。TNF-α對MMP-28具有調控作用，且呈濃度依賴性。結合Séguin等[7]結果，推測MMP-28可能是TNF-α參與椎間盤退變的介質之一。IL-1β不能影響髓核細胞MMP-28 mRNA轉錄，而TNF-α對MMP-28 mRNA轉錄有刺激作用，且呈濃度依賴性，這與Saarialho-Kere等[8]報道類似。也有研究表明，TNF-α對髓核細胞MMP-28的表達無明顯調控作用，但其實驗對象是退變髓核細胞，結合本實驗結果，推測TNF-α可能只在早期參與調控正常髓核細胞MMP-28表達，當髓核細胞發生退變后，可能對TNF-α反應降低，從而出現TNF-α不能有效刺激退變髓核細胞表達MMP-28的現象。

本研究僅建立單一炎癥因子刺激的體外細胞培養模型，不能完全代表人體內復雜的生理環境，由于多種炎癥因子參與椎間盤退變，且細胞因子之間是相互影響、相互依賴的，關于炎癥因子與MMP-28之間的相互作用及如何影響椎間盤退變還需要更深入的研究。

椎間盤不僅是椎體間強有力的連接結構，同時也是很好的震蕩吸收裝置，施加于脊柱的各種不同載荷，引起椎間盤的相應變形，使力得到重新分布及部分吸收，此生物學功能主要依賴椎間盤細胞外基質完成，一旦基質破壞將導致椎間盤不能有效的、均勻的重新分布及吸收載荷，出現應力集中，最終將發生椎間盤突出。椎間盤突出的治療，不論是非手術還是手術，都各有利弊，采用分子生物學途徑抑制椎間盤細胞外基質降解，阻止椎間盤退變才是最有效的治療，本實驗試圖探討MMP-28與椎間盤的退變的關系，為椎間盤退變的靶向治療提供思考。

參考文獻

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