結腸癌中caspase9表達程度與癌周炎癥程度關系的研究

木爾扯爾，文 彬，黃一凡，劉 鈞

(1.川北醫學院法醫系；2.川北醫學院附屬醫院病理科，四川 南充 637000)

以往的研究顯示，線粒體凋亡途徑的核心因子caspase9在結直腸癌中表達下降[1-4]；但本課題組先前的研究中，用IHC和RT-PCR法研究了大樣本人體結腸癌中caspase9蛋白和mRNA的表達，卻發現結腸癌中caspase9蛋白、mRNA的表達與正常結腸相比表達并無降低，反而有升高的趨勢(另文發表，尚未見刊)。經過仔細分析，發現部分切片的癌周組織中有程度不等的炎細胞浸潤現象。會不會是結腸癌周圍炎細胞的浸潤引起caspase9表達異常升高，從而拮抗腫瘤發生時抑制caspase9表達的作用？查閱文獻，發現以下研究與我們的問題相關：如于慶生等[5]發現，大鼠腸黏膜受到缺血-再灌注損傷后，發生炎癥的腸黏膜中caspase9等凋亡因子的mRNA顯著增多，而用藥物控制缺血-再灌注引起的腸黏膜炎癥后，caspase9等凋亡因子mRNA又顯著減少；王衛等[6]亦發現在高糖刺激下，腎小管上皮NRK-52E細胞株中炎癥介質NLRP3(核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族NLRs的成員)的表達明顯增高，且凋亡相關因子caspase-3蛋白的表達也隨之增高，細胞凋亡率升高；而用SiRNA轉染方法抑制NLRP3表達后，細胞凋亡受到明顯抑制。另有研究發現，NLRs另一個成員NALP1不僅可與caspase5結合形成炎癥復合體，激活caspase1和caspase5及其下游的炎癥因子如IL-1β，IL-18和IL-33的前體，促進炎癥反應的發展，也可與細胞線粒體凋亡途徑的Apaf-1，caspase9相互作用，促進細胞的凋亡[7]。以上這些文獻雖然都不是研究腫瘤凋亡與炎癥之間關系的直接文獻，但證明組織發生炎癥后，可引起caspase9表達升高和細胞凋亡增多。基于這些提示，我們研究了caspase9表達程度與腫瘤周圍炎細胞浸潤程度的關系，以期分析先前我們實驗結果與其他研究不符的原因，并初步探討腫瘤形成后，炎癥對腫瘤凋亡的影響作用。

1 材料與方法

1.1 標本

川北醫學院附屬醫院病理科確診存檔的2004年至2006年原發性結腸癌蠟塊138例。其中男性89例，女性49例；最小16歲，最大84歲，平均(56.0±13.7)歲，中位年齡57歲。其中管狀腺癌109例(78.9%)，黏液腺癌23例(16.7%)，管狀腺癌合并黏液腺癌的3例(2.2%)，乳頭狀腺癌2例(1.4%)，未分化癌1例(0.7%)，未見其他如腺鱗癌、小細胞癌及類癌等組織學類型病例。以上實驗標本均未做過術前放化療，患者均知情同意，符合醫學倫理學相關規定。

1.2 免疫組化染色

caspase9兔抗人多克隆濃縮抗體購自福建邁新公司。caspase9蛋白的表達采用EnVision兩步法檢測，抗體濃度1∶200。結果判定：caspase9棕黃色或棕黑色顆粒主要定位于細胞質，部分可定位于細胞核。根據陽性細胞的百分比對組織切片進行測定劃分：0分，無上皮性細胞著色；1分，<25%的上皮性細胞陽性；2分，25%～50%的上皮性細胞陽性；3分，50%～75%的上皮性細胞陽性，4分，>75%的上皮性細胞陽性。著色強度則用以下方法測定：0分，無陽性細胞 ；1分，輕微著色；2分，中度著色；3分，高度著色。將兩分數相加，得分在0～7之間。切片觀察由2個高年資病理醫師單獨進行打分，最后取平均分，0～2分為陰性，3分及以上為陽性(3分為﹢，4～5分為﹢﹢，6～7分為﹢﹢﹢)。

1.3 癌周炎癥程度的確定

結腸癌癌周的炎癥程度確定參照非癌組織的炎癥程度判斷方法：從炎細胞分布密度，炎細胞組織浸潤面積和組織浸潤深度三方面綜合評估，該工作也由兩個高年資的病理醫師進行，結果分為無、輕度、中度和重度炎細胞浸潤四個等級。結果不一致的重新討論后確定，最后將結果與免疫組化染色結果綜合進行計數統計。

1.4 統計學分析

采用SPASS 13.0進行統計分析，等級資料相關分析用spearman秩相關分析。

2 結果

138例結腸癌中caspase9蛋白表達與癌周炎癥程度的相關性分析：以癌周炎癥程度將138例結腸癌分成四組： A組為重度炎細胞浸潤組(27例)；B組為中度炎細胞浸潤組(28例)；C組為輕度炎細胞浸潤組(43例)；D組為無炎細胞浸潤組(40例)。對癌周炎癥程度與癌中caspase9蛋白表達進行spearman相關性分析，結果顯示(表1)。癌周炎癥程度等級與結腸癌中caspase9的陽性程度表達呈正相關，spearman秩相關系數rs=0.364，P=0.000。

表1 癌周炎癥程度與癌中caspase9蛋白表達的spearman相關分析

*R×C 秩相關分析，P<0.01。

3 討論

結直腸癌的發生與經典wnt通路的異常有極其密切的關系：當wnt通路發生異常時，β-catenin可出現胞質內異常表達[8]，進而可轉位入核，激活下游增殖相關調控信號和抑制下游凋亡相關通路的激活，使細胞發生過度增殖，最后導致結腸腫瘤的發生。以caspase9為核心的線粒體凋亡途徑正是照wnt通路下游的一個凋亡通路[9]。因此按wnt通路與線粒體凋亡途徑理論上的關系，當結腸癌發生后，癌中caspase9表達理應下降，凋亡減少； caspase9蛋白在不同結腸組織的表達也應滿足如下的關系：正常結腸>結腸腺瘤>結腸癌。然而我們先前的實驗結果卻出現了與上述理論相反的結果：caspase9蛋白、mRNA在結腸癌中caspase9表達均高于其在正常結腸組織中表達。

為進一步分析實驗結果與理論相悖的原因，我們分析了138例結腸癌中caspase9表達程度與癌周炎癥程度的關系。結果顯示，癌周炎癥程度與結腸癌中caspase9的陽性程度表達呈spearman正相關關系，且有統計學意義；caspase9在炎癥程度等級為A、B組結腸癌中的陽性表達(圖1)顯著高于癌周浸潤程度為C、D組結腸癌組中表達(圖2)。這些結果提示，結腸癌中caspase9蛋白的表達程度隨炎癥程度的加劇而升高；但若caspase9在結腸癌中表達上升，會進一步激活以caspase9為核心的細胞線粒體凋亡途徑，從而促進癌細胞的凋亡；因此從這個角度來講，顯然癌周炎癥對癌患者是有益的，因為其起了抗癌的作用。在臨床上也可以見到這樣的現象，即癌患者腫瘤組織中炎癥越重(非腫瘤中心及壞死引起的炎癥)，其手術預后反而較好，可能就與炎癥參與抗腫瘤作用有關。然而根據傳統的觀點，炎癥卻是導致結腸癌發生發展的重要因素，特別是慢性炎癥與結直腸癌的發生有極為密切的關系：在持續炎癥的刺激下，正常結腸逐漸發生瘤變產生結腸腺瘤，最后在結腸腺瘤的基礎上進一步發展為結腸癌[10]，因此病理學上把結直腸的慢性炎癥歸為是癌前病變。雖然目前研究炎癥與腫瘤發生之間關系的文獻主要以炎癥如何引起腫瘤發生為主[11]，而對腫瘤生成后，炎癥對腫瘤影響作用的研究甚少；但根據本實驗結果結合傳統的觀點[10-11]，結合國內外文獻的提示[5-7，12]，筆者推測炎癥在腫瘤的不同階段，可能扮演了不同的角色，早期炎癥對腫瘤的發生起促進作用，晚期對腫瘤起抗腫瘤免疫的角色，從而使機體抗腫瘤免疫作用增強，激活了細胞凋亡途徑，而caspase9為核心的細胞線粒體凋亡途徑就是被激活的其中之一。

但以上觀點畢竟只是實驗基礎上的一種推測，要充分證明結腸癌形成后炎癥對結腸癌起抗腫瘤免疫的作用，還需要更深入的實驗來證明，這也是我們下一步的實驗目標。

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