上皮性鈣黏附蛋白及基質金屬蛋白酶-9在皮膚黑色素瘤及色素痣中的表達及意義

楊慧敏，黃一凡，謝賢鏞，李祖茂

(川北醫學院基礎醫學院病理學教研室，四川 南充 637000)

黑色素瘤(melanoma)，又稱為惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)，是一種能夠產生黑色素的高度惡性腫瘤，多見于30歲以上人群，多發于皮膚即皮膚黑色素瘤(cutaneous melanoma，CM)，亦可見于黏膜及脈絡膜等處。CM具有高惡性度及高轉移率的特點，其發生與過度日曬、紫外線照射、皮膚色素痣等有關。臨床上非典型痣及病理上發育異常痣與黑色素瘤的高危險性相關，有文獻報道[1]，有10個以上非典型痣的個體發生MM的相對危險度為12(95%，CI 4.4～31)，并與全身痣的數量互為獨立危險因素。本研究擬通過免疫組織化學方法觀察CM及色素痣中上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)及基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達情況，探討E-cadherin與MMP-9在CM發生發展過程中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 收集川北醫學院附屬醫院病理科2008年至2012年手術切除標本68例，其中CM 48例，色素痣20例(皮內痣及交界痣各10例)，均為福爾馬林固定后石蠟包埋標本，所有病例HE染色后經高年資病理診斷醫師復診確認。CM患者中，年齡25～78歲，中位數55歲；男性27例，女性21例；病變位于足部18例，外陰9例，腿部8例，上肢和手部7例，軀干及頭面部6例；有明確淋巴結轉移者17例(復發和遠處轉移情況不限)；腫瘤厚度于光鏡下直接測量，浸潤深度及分型參照相關文獻[2]確定；所有病例術前未經放化療。

1.1.2 主要試劑 即用型兔抗人E-cadherin單克隆抗體、即用型兔抗人MMP-9單克隆抗體、PV-9000免疫組化檢測試劑盒及濃縮型DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色法 采用EnVision二步法，按抗體及試劑盒說明書操作，具體如下：石蠟包埋組織塊切4 μm厚連續切片，常規脫蠟、水化組織切片；3% H2O2去離子水孵育10 min；E-cadherin檢測切片采用1 mM EDTA(pH8.0)高壓熱修復，MMP-9檢測切片采用0.01 M檸檬酸緩沖液(pH6.0)高壓熱修復；滴加一抗工作液，4 ℃過夜，后PBS沖洗，2 min×3次；滴加試劑1，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次；滴加試劑2，37 ℃孵育20～30 min，PBS沖洗，2 min×3次；應用DAB工作液顯色5 min左右，自來水充分沖洗、蘇木素復染、脫水、透明、封片。用PBS替代一抗做陰性對照，用已知陽性的結腸癌/肝臟組織切片做為E-cadherin/ MMP-9檢測的陽性對照。

1.2.2 結果判定 E-cadherin陽性標準為細胞膜/細胞質著色，MMP-9陽性標準為細胞質著色，表示為陽性部位呈均勻顆粒狀或線性棕黃色。每張切片隨機觀察10個高倍鏡(400×)視野，對比背景著色觀察細胞染色強度及計數陽性細胞數。E-cadherin陽性結果參考江文靜等[3]的方法，即先按染色強度計分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再按陽性細胞所占百分比計分：顯示明顯的黃色或棕黃色顆粒視為陽性著色。陰性為0分，陽性細胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項計分相加所得總分進行結果判定：0～2分為陰性(-)，3～4分為弱陽性(+)，>4分為強陽性(++)，即3分及以上則判定為陽性。MMP-9陽性結果參考王連等[4]的方法：先按染色強度計分：無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。再按陽性細胞所占的百分比計分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。陽性強度為兩種記分之和：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～5分為中等強度陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)，即1分及以上則判定為陽性。

1.3 統計學分析

采用SPSS11.5統計軟件進行，組間比較采用卡方檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 E-cadherin及MMP-9表達情況

CM組織中E-cadherin及MMP-9陽性表達率分別為37.5%(18/48)及79.2%(38/48)；色素痣組織中E-cadherin及MMP-9的陽性表達率分別為85%(17/20)及10%(2/20)[其中交界痣組織中陽性表達率分別為80%(8/10)及20%(2/10)，皮內痣組織中陽性表達率分別為90%(9/10)及0%(0/10)]。E-cadherin及MMP-9在CM與色素痣中表達比較，差異均有統計學意義(χ2值分別為12.752及27.884，P均<0.01)。在兩種色素痣中E-cadherin及MMP-9的表達差異無統計學意義，P均>0.05。

2.2 E-cadherin及MMP-9表達與CM病例臨床病理特征的關系

E-cadherin和MMP-9的表達與腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移有關(P<0.05)，與患者的年齡、性別、腫瘤厚度及分型無關(P>0.05)(表1)。

2.3 E-cadherin及MMP-9在CM中表達的相關性

E-cadherin及MMP-9在CM中的表達呈負相關(r=-0.45，P<0.01)，見表2。

表1 E-cadherin及MMP-9在CM中表達與患者臨床病理特征的關系

表2 E-cadherin及MMP-9在CM中表達的相關性

3 討論

惡性腫瘤轉移過程的重要步驟包括細胞外基質和基底膜的降解，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在其中擔任了重要的角色。MMPs是一類肽鏈內切酶，目前發現的有20多種，可降解組織基底膜和細胞外基質的多種蛋白質成分[5]。MMP-9是分子量為92 kDa的明膠酶B，主要由巨噬細胞及某些腫瘤細胞合成分泌，可降解Ⅳ、Ⅴ型膠原等。基底膜的主要成分為Ⅳ型膠原，因此MMP-9在腫瘤的浸潤和轉移過程中起著十分重要的作用，其表達增加與腫瘤浸潤轉移風險的增加呈正相關，這一結論已在對多種惡性腫瘤的研究中得到證實[6-7]。

鈣黏附蛋白(cadherin)是一類與Ca2+依賴性細胞間黏附相關的糖蛋白，包括E-、P-、N-cadherin等。E-cadherin是一種穿膜蛋白，在大多數上皮組織中表達，在上皮細胞黏附中發揮重要作用，其下調與多種上皮源性腫瘤轉移和預后不良有一定的相關性[8]。

雖然這兩種蛋白在惡性腫瘤浸潤轉移中的作用已在研究中被證實，但其在CM及色素痣中的表達情況卻鮮有報道。本實驗研究采用免疫組織化學方法，檢測48例CM及20例色素痣組織中E-cadherin及MMP-9的表達，結果顯示，與色素痣組織相比，MMP-9在CM中表達明顯增高，差異具有統計學意義，這一結果與張娟等[9]的研究結果相一致，提示MMP-9可能在CM的發生發展特別是色素痣惡性演變中起重要作用。紀長偉等[10]發現，在黑色素瘤荷瘤小鼠腫瘤病灶中E-cadherin的表達隨發病時間推移下調，而本研究結果提示E-cadherin在CM中表達較色素痣中有明顯降低，提示E-cadherin的表達缺失可能與CM浸潤進展有關。

有關E-cadherin和MMP-9在腫瘤中特別是在CM中表達的關系文獻報道很少，Akdeniz等[11]研究發現，隨喉鱗癌分化程度降低，MMP-9的表達增高，而E-cadherin表達則降低，且E-cadherin表達降低與淋巴結轉移程度有關。在E-cadherin和MMP-9與CM患者臨床病理特征的關系研究中發現：E-cadherin和MMP-9在CM中的表達變化與腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移有關，但與其余臨床病理特征如年齡、性別等關系無統計學意義。浸潤深度與淋巴結轉移是影響CM預后的重要因素，提示E-cadherin表達下調及MMP-9表達增高或可作為判斷CM預后不良的指標。對E-cadherin和MMP-9在CM中的相關性分析顯示二者表達具有負相關性，提示MMP-9表達上調伴隨有E-cadherin表達下調，可能與E-cadherin下調致使腫瘤細胞間黏附松散，便于脫離原發灶往間質浸潤及遠處轉移有關，二者之間是否存在拮抗作用及其作用機制有待進一步研究。

綜上所述，通過本實驗研究我們認為MMP-9及E-cadherin表達與黑色素瘤發生、發展有關。MMP-9上調可能與E-cadherin下調共同促進了黑色素瘤的浸潤及淋巴結轉移，臨床病理檢測CM組織中E-cadherin及MMP-9的表達可能對腫瘤的浸潤及淋巴道轉移風險高低起到預測作用。

【參考文獻】

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