氟致成骨細胞內質網應激對骨轉化基因表達的影響

張亞樓，孫小娜，李 甜，馮樹梅，廖禮彬，鄧 鋒，鐘近潔*

(1.新疆醫科大學基礎醫學院組織胚胎學教研室，新疆烏魯木齊830011;2.新疆疾病預防控制中心放射衛生科，新疆烏魯木齊830011)

攝入過量氟能夠引起成年人氟骨癥。研究發現氟可以誘導成骨細胞內質網應激，同時會對成骨細胞的骨發生作用產生影響［1］。將氟誘導的成骨細胞內質網應激與骨轉化基因進行聯合系統的研究未見報道。本研究用PCR 芯片觀察成骨細胞內質網應激情況下骨轉化相關基因的變化，為探索氟中毒機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料:NaF，分析純(上海生工公司)、RNeasy Plus Mini Kit、RT2 First Strand Kit 和RT2 SYBR Green qPCR Mastermix、PCR 芯片(未折疊蛋白反應PAHS-089ZA-2 和骨發生信號通路PAHS-026ZA-2)(Qiagen 公司)。

1.2 細胞培養:原代培養人成骨細胞(鐘近潔教授贈送)，細胞在含10%胎牛血清的DMEM 培養基于37 ℃、5% CO2培養箱進行貼壁培養。

1.3 凋亡細胞的流式細胞儀檢測:將成骨細胞接種于25 cm2的培養瓶中，待細胞長至鏡下細胞匯合度為80%時，加入氟化鈉(NaF)(0 和10 mg/L)作用24 h 后，制成單細胞懸液，用AnnexinⅤ和PI 雙染色在流式細胞儀上進行早期細胞凋亡的檢測。

1.4 PCR 芯片檢測:用NaF 干預成骨細胞24 h 后，提取RNA。分光光度計測定其濃度，瓊脂糖凝膠電泳測定其RNA完整性。取400 ng RNA 反轉錄合成cDNA，加樣于PCR 芯片上，于熒光定量PCR 儀上進行實時定量PCR 反應。計算每張PCR 芯片中的每個基因的Ct 值。每種處理組重復用PCR芯片測定3 次。采用2－ΔΔCt方法比較相應基因的表達量變化。表達量差異在2 倍以上者為差異有意義基因。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測凋亡結果:當氟化鈉濃度為10 mg/L時，人成骨細胞凋亡率為14.2 %。

2.2 未折疊蛋白反應PCR 芯片結果:在總共84 個檢測基因中表達下調的有:FBXO6 基因;表達上調的有:BIP、XBP1、ATF4、PERK、IRE1α、IRE1β、ERO1LB、JNK3、PDIA3、USP14、HSPA1L、HSPH1、HTRA4 和UGCGL1 等14 個基因。

2.3 骨發生PCR 芯片結果:表達上調的基因有:AHSG、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALPL)、二聚糖(biglycan，BGN)、BMP2、BMP3、BMP5、BMP6、BMP7、降鈣素受體(calcitonin receptor，CALCR)、脊索蛋白(chordin，CHRD)、COL10A1、COL1A1、COL2A1、COL5A1、軟骨寡聚物基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)、DLX5、FLT1(VEGFR-1)、纖維連接蛋白(fibronectin，FN1)、GDF10、IGF1、IGF2、IHH、ITGA2(integrin alpha 2)、ITGAM(CD11B/integrin alpha M)、MMP10、MMP9、PDGFA、PHEX、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、TNF、TNFSF11、VEGFA;表達下調的基因有:NOG、VCAM1。其中:BMP2、BMP3、BMP5、BMP6、BMP7 屬于骨形態發生蛋白家族;COL10A1、COL1A1、COL2A1、COL5A1 屬于膠原家族;IGF1、IGF2 屬于胰島素樣生長因子家族;ITGA2、ITGAM 屬于整合素α 家族;MMP10、MMP9 屬于基質金屬蛋白酶家族;TNF、TNFSF11 屬于腫瘤壞死因子家族;FLT1 和VEGFA 屬于血管生長因子家族。各基因間的相互關系根據軟件繪制如圖1。

3 討論

熒光定量PCR Array 是目前較為簡單實用的檢測基因表達的方法，能夠1 次性檢測84 個與UPR 相關的基因在mRNA水平上的表達，結果無需再進行實時熒光定量檢測，可同時研究信號通路的大量基因。本研究利用這一技術研究氟化鈉作用下成骨細胞內質網應激和骨發生信號通路，完整地了解這兩面的變化情況。

從實驗結果看，氟化鈉誘導了人成骨細胞內質網應激，其標志分子BIP 和XBP1 均表達;此外誘導了3 條信號通路:PERK、IRE1 和ATF6，3 種分子均高表達。檢出的ATF4 則屬于PERK-Eif2α 途徑下游的分子。說明內質網應激及未折疊蛋白反應被過量氟激活，以減輕未折疊蛋白質的堆積，避免后者造成細胞損傷。

圖1 各骨轉化基因間的相互關系圖Fig 1 The interaction of bone turn-over genes

成骨細胞在過量氟作用下，激發了內質網應激，同時對成骨細胞分化也產生了影響。本研究結果很多已經獲得了證實，如:氟對成骨細胞的BMP 家族分子的影響已被證實;對膠原家族的影響也已經證實［2］;本研究中氟對降鈣素的影響與報道一致;而氟對MMP9 和VEGF 等影響也與以往報道相符［3］。對于氟作用下的DLX5(Dlx5 屬于同源異型盒homeobox，Hox 基因家族)已有研究［4］。以上說明本研究結果是可靠的。

通過PCR 芯片研究結果發現，氟中毒研究中許多以前被孤立研究的基因相互間是有關聯的，同時還發現了以前忽略的方面如整合素等，這也指出了今后研究的方向。內質網應激可能參與了氟對成骨細胞分化的作用。

［1］Zhou YL，Shi HY，Li XN，et al.Role of endoplasmic reticulum stress in aberrant activation of fluoride-treated osteoblasts［J］.Biol Trace Elem Res，2013，154:448-56.

［2］張亞樓，劉開泰，劉繼文，等.氟對成骨細胞Runx2 和Osterix 表達的影響［J］.中國地方病學雜志，2011，30:23-26.

［3］申慶豐，李輝南，徐天同，等.慢性氟中毒大鼠脊髓血腦屏障損傷的研究［J］.中華醫學雜志，2012，92:2357-2361.

［4］萬良斌，于燕妮，萬昌武.同源異型盒基因Dlx5 在氟中毒骨代謝中作用［J］.中國公共衛生，2013，29:620-622.