熱休克蛋白70對骨骼肌細(xì)胞系(C2C12)葡萄糖代謝的影響

王 磊，王 尊，楊偉偉

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)系，江蘇南京210001)

熱休克蛋白70(heat shock protein，HSP70)是最重要的應(yīng)激反應(yīng)蛋白，其最基本功能是感受刺激和分子伴侶功能［1］。骨骼肌細(xì)胞正常狀態(tài)下HSP70 表達(dá)水平很低，當(dāng)受到各種內(nèi)外環(huán)境刺激時，HSP70 的表達(dá)快速的升高，起多種保護(hù)作用維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。研究表明HSP70 的表達(dá)水平與骨骼肌細(xì)胞葡萄糖代謝的紊亂程度相關(guān)，包括ATP 的耗竭，儲存的糖原的下降以及乳酸的積聚等［2］，提示HSP70 對骨骼肌細(xì)胞葡萄糖代謝產(chǎn)生影響，但具體作用及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。本研究通過構(gòu)建高表達(dá)HSP70 的C2C12 細(xì)胞系，研究HSP70 對骨骼肌細(xì)胞葡萄糖代謝影響及相關(guān)機(jī)制，為最終闡明HSP70 在骨骼肌細(xì)胞葡萄糖代謝中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

真核表達(dá)載體pTRE2hyg(Novagen 公司);含有人HSP70cDNA(ATCC57494)的質(zhì)粒pAT153(德國ULM 大學(xué)Yuefei Liu 教授惠贈);RNeasy Mini Kit及real-time PCR 試劑盒(QIAGEN 公司);HSP70 抗體和ATP biolumin-escence assay 試劑(Sigma 公司);C2C12 細(xì)胞系，DMEM 培養(yǎng)基，G418 和小牛血清(Gibico 公司)。葡萄糖測定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);3H-2 －脫氧葡萄糖(放射性比活度5.4 Bq/mmol)(中國同位素總公司);HK、PK、PFK 和LDH 的活性測定試劑盒及Glut4 抗體(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組:將C2C12 細(xì)胞分為HSP70 轉(zhuǎn)染組與正常對照組，分別培養(yǎng)分化后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.2 構(gòu)建重組pTRE2hyg-HSP70 質(zhì)粒:1)用Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶切開含有人HSP70 cDNA 的質(zhì)粒pAT153，用NheⅠ限制內(nèi)切酶切開載體pTRE2hyg，補(bǔ)平切出的黏性末端;2)經(jīng)過電泳，純化得到HSP70 cDNA 和pTRE2hyg 分子;3)將純化的HSP70和pTRE2hyg 分子按1∶3 的比例用T4 連接酶進(jìn)行連接，后轉(zhuǎn)化到DH5α 菌株中，以含氨芐青霉素篩選抗性克隆。4)將挑選出的克隆進(jìn)行BamHⅠ酶切鑒定后，大量制備重組質(zhì)粒pTRE2hyg-HSP70。

1.2.3 C2C12 細(xì)胞培養(yǎng):骨骼肌細(xì)胞系C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)于5% CO2和37 ℃培養(yǎng)箱中，DMEM 培養(yǎng)基中含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清1 ×105U/L 青霉素100 mg/L 鏈霉素。

1.2.4 重組pTRE2hyg-HSP70 質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞系:1)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方法將pTRE2 hyg-HSP70 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C2C12 細(xì)胞:取5 μL Lipofectin?Reagent 與100 μLOpti ? -MEM 混合30 min，取0.7 μg重組pTRE2hyg-HSP70 質(zhì)粒溶于100 μL 的無血清培養(yǎng)液中并加入PLUS 混合15 min。并轉(zhuǎn)染C2C12 細(xì)胞3 h 后，置換為含10%血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。按1∶10 稀釋細(xì)胞轉(zhuǎn)至10 cm 培養(yǎng)皿，次日加入終濃度為500 mg/L 的G418 進(jìn)行篩選。3)檢測轉(zhuǎn)染后的C2C12 細(xì)胞表達(dá)HSP70:選取抗性細(xì)胞克隆，采用1 μg/mL 的強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)后，Western blot 方法檢測HSP70 的表達(dá)情況。4)取細(xì)胞以5 × 105/mL 接種于將96 孔板中，換為含50 mL/L馬血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化成為肌小管(myotube)，在倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化情況，當(dāng)在鏡下見80%～90%的細(xì)胞匯合時取用。

1.2.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C2C12 細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生的檢測:將96 孔板中誘導(dǎo)分化的C2C12 骨骼肌細(xì)胞，以含1% BSA 低糖DMEM 培養(yǎng)基孵化8 h，然后以葡萄糖氧化酶法檢測每孔培養(yǎng)基中的葡萄糖含量。用不含細(xì)胞的培養(yǎng)孔內(nèi)培養(yǎng)基中的葡萄糖含量的均值減去各組培養(yǎng)孔培養(yǎng)基中剩余的葡萄糖含量，即為每孔細(xì)胞的葡萄糖消耗量。具體操作步驟見試劑盒說明。同時用YSI 2300 STAT PLUS 乳酸生化分析儀檢測培養(yǎng)基中乳酸的濃度，并通過計算得出每8 h 葡萄糖的消耗及乳酸的產(chǎn)生量。

1.2.6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C2C12 細(xì)胞葡萄糖攝取的測定:接種5 ×105/mL 細(xì)胞于孔板中，分化培養(yǎng)至80%～90%匯合，置換無血清5.5 mmol/L 葡萄糖的MEM培養(yǎng)液，讓細(xì)胞處在無血清和低糖狀態(tài)。每孔加入37 kBq3H-2-脫氧葡萄糖，在室溫下放置10 min。每孔立即加入10 μL 濃度為0.48 g/L 細(xì)胞松弛素B(終濃度為10 μmol/L)，終止攝取。用PBS 沖洗2次，每孔加入0.5 g/L NaOH 200 μL，室溫靜置2 h，裂解細(xì)胞，吸附后液爍計數(shù)檢測。

1.2.7 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C2C12 細(xì)胞內(nèi)ATP 水平的檢測:收集孔板中分化C2C12 細(xì)胞，用冰PBS(pH 7.4)洗凈后，加入Tris EDTA 緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl和4 mmol/L EDTA，pH 7.55)在100 ℃孵育3 min后，10 000 ×g 離心2 min 取上清。采用ATP 生物發(fā)光檢測試劑檢測ATP 的含量。ATP 的水平將從ATP(1.56～800 nmol/L)標(biāo)準(zhǔn)的雙對數(shù)曲線中計算出來，以nmol/mg pro.來表示。

1.2.8 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C2C12 細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶活性的檢測:收集孔板中分化C2C12 細(xì)胞，用PBS 重新懸浮，反復(fù)凍融3 次，4 ℃，2 000 ×g 離心20 min，取上清液檢測PFK、LDH、HK 和PK 的活性，具體步驟見文獻(xiàn)［3］。以上各種酶的活性通過耦合NADP 的減少或NADH 的氧化進(jìn)行，并通過分光光度計檢測在334 nm 處的吸光度值，酶活性的結(jié)果采用nmol/min·mg pro.來表示。

1.2.9 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C2C12 細(xì)胞膜Glut4 的表達(dá)檢測:1)收集孔板中分化C2C12 細(xì)胞，用PBS 重新懸浮，反復(fù)凍融3 次，4 ℃，9 000 ×g 高速離心10 min，保留上清。將上清以4 ℃，190 000 × g 超高速離心1 h，取沉淀鋪于25%、30%、35% 蔗糖梯度上，4 ℃，150 000 ×g 超離心16 h。于25%蔗糖層得到骨骼肌細(xì)胞膜懸濁液，35%層上得到骨骼肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜懸濁液。膜蛋白濃度用蛋白定量試劑盒測定。2)蛋白定量后，取25 μL 樣品10%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS 凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉，然后加入兔抗鼠Glut4 單克隆抗體過夜(4 ℃)，洗滌后與HRP 標(biāo)記的抗兔IgG 抗體室溫孵育1 h(37 ℃)，凝膠成像系統(tǒng)檢測Western blot 蛋白條帶，經(jīng)β-actin 校正，gene 軟件分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒酶切鑒定及PCR 質(zhì)粒鑒定

成功構(gòu)建pTRE2hyg-HSP70 質(zhì)粒。P1:pAT153質(zhì)粒被HindIII 和BamHI 酶切(2.3 kb 和3.4 kb);P2:Hind Ⅲ酶切pAT153 (5.7 kb);P3:修飾后pTRE2hyg 載體(2.3 kb);P4:修飾后目標(biāo)基因HSP70(5.3 kb);P5:重組pTRE2hyg-HSP70 質(zhì)粒(7.6 kb);M:1 kb DNA marker(圖1)。

圖1 pTRE2hyg-HSP70 質(zhì)粒重組鑒定Fig 1 pTRE2hyg-HSP70 recombinant plasmid colony by PCR identified

2.2 C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)及pTRE2hyg-HSP70 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C2C12 細(xì)胞

C2C12 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后篩選發(fā)現(xiàn)(No5 C 組和No12 D 組)克隆經(jīng)過誘導(dǎo)后能夠穩(wěn)定高效的表達(dá)HSP70，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C2C12 成功(圖2)。

2.3 高表達(dá)HSP70 的C2C12 細(xì)胞葡萄糖消耗、乳酸產(chǎn)生及葡萄糖攝取的檢測

與對照組相比，在細(xì)胞分化后的3 和7 d，過表達(dá)HSP70 的C2C12 細(xì)胞每8 h 葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)生量都明顯增加(P＜0.01)，胰島素刺激的葡萄糖攝取量也明顯增加(P＜0.05)(表1)。

2.4 高表達(dá)HSP70 對C2C12 細(xì)胞內(nèi)ATP 水平的影響

與對照組相比，在細(xì)胞分化后的3 和7 d，過表達(dá)HSP70 的C2C12 細(xì)胞ATP 水平明顯升高(P＜0.01)(表1)。

圖2 pTRE2hyg-HSP70 轉(zhuǎn)染C2C12 細(xì)胞后HSP70 的表達(dá)Fig 2 The expression of HSP70 in C2C12 cells after pTRE2hyg-HSP70 transfection

2.5 高表達(dá)HSP70 的C2C12 細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶的檢測

與對照組相比，在細(xì)胞分化后的3 和7 d，過表達(dá)HSP70 的C2C12 細(xì)胞PFK，HK，PK(P＜0.01)和LDH(P＜0.05)的活性均顯著增加(表2)。

2.6 高表達(dá)HSP70 的C2C12 細(xì)胞膜Glut4 的表達(dá)檢測

對照組相比，在細(xì)胞分化后的3 和7 d，過表達(dá)HSP70 的C2C12 細(xì)胞膜Glut4 蛋白的表達(dá)明顯增高(P＜0.05)(圖3)。

圖3 高表達(dá)HSP70 的C2C12 細(xì)胞膜Glut4 的表達(dá)Fig 3 The expression of plasma membrane Glut4 in protein level in up-regulated HSP70 C2C12 cells

3 討論

骨骼肌細(xì)胞葡萄糖代謝功能對其能量平衡十分重要，也同許多重要的疾病密切相關(guān)。HSP70 是重要的應(yīng)激反應(yīng)蛋白，具有保護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能。研究表明，許多刺激可以同時引起肌細(xì)胞糖代謝的紊亂及HSP70 表達(dá)的變化，且HSP70 功能的實現(xiàn)有賴于能量(ATP)的供給，提示HSP70 可能直接或間接對肌細(xì)胞的葡萄糖代謝產(chǎn)生影響［4］，但目前尚無直接證據(jù)。

表1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP70 后C2C12 細(xì)胞葡萄糖消耗、乳酸產(chǎn)生、葡萄糖攝取及細(xì)胞內(nèi)ATP 水平變化Table 1 Changes of glucose consumption，glucose uptake，lactate production and ATP level in tansfected C2C12 cells (±s，n=3)

表1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP70 后C2C12 細(xì)胞葡萄糖消耗、乳酸產(chǎn)生、葡萄糖攝取及細(xì)胞內(nèi)ATP 水平變化Table 1 Changes of glucose consumption，glucose uptake，lactate production and ATP level in tansfected C2C12 cells (±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control.

groupglucose consumption(mmol/L/107 cells/8 hours)lactate production(mmol/L/107 cells/8 hours)glucose uptake(nmol/L/107cells/h)ATP level(nmol/mg protein)normal control3.63 ±1.025.33 ±1.533.85 ±0.395.62 ±1.32 transfected group 3 days7.32 ±2.35＊＊14.62 ±4.36＊＊5.68 ±1.48*13.43 ±3.89＊＊transfected group 7 days7.51 ±2.16＊＊13.35 ±4.21＊＊5.87 ±1.34*14.82 ±4.08＊＊

表2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP70 后C2C12 細(xì)胞葡萄糖酵解關(guān)鍵酶活性的變化Table 2 Changes of activities of enzymes involved in glycolysis in tansfected C2C12 cells(nmol/min·mg protein，±s，n=3)

表2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP70 后C2C12 細(xì)胞葡萄糖酵解關(guān)鍵酶活性的變化Table 2 Changes of activities of enzymes involved in glycolysis in tansfected C2C12 cells(nmol/min·mg protein，±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control.

groupPKFLDHHKPK normal control18.63 ±5.243 900 ±4682.61 ±0.6516.43 ±3.78 transfected group 3 days38.57 ±13.45＊＊5 879 ±821*6.93 ±1.69＊＊31.25 ±9.63＊＊transfected group 7 days41.65 ±15.26＊＊6 123 ±854*6.85 ±1.54＊＊34.31 ±9.67＊＊

本研究結(jié)果顯示高表達(dá)HSP70 的骨骼肌細(xì)胞能夠增加葡萄糖的攝取和利用，增加細(xì)胞內(nèi)ATP 的含量，提高與葡萄糖酵解相關(guān)的酶的活性，顯示了高表達(dá)的HSP70 能夠加速骨骼肌細(xì)胞的糖酵解，明確了HSP70 對葡萄糖代謝的直接作用。相關(guān)研究也證實，如運動，缺血等刺激都可以引起骨骼肌細(xì)胞HSP70 的表達(dá)，并且HSP70 表達(dá)的水平同刺激的類型、強(qiáng)度和時間密切相關(guān)［5］。如骨骼肌細(xì)胞糖原和ATP 的耗竭，乳酸的堆積，氧自由基的產(chǎn)生等都可以促進(jìn)細(xì)胞HSP70 的表達(dá)［6-7］。結(jié)合本實驗結(jié)果，HSP70 可以通過加速葡萄糖的攝取和糖酵解，快速產(chǎn)生ATP 來滿足細(xì)胞對能量的需求。之前的研究中也發(fā)現(xiàn)，低頻率(10 Hz)長時間(90 min)的刺激可引起C2C12 細(xì)胞高表達(dá)HSP70，同時伴有培養(yǎng)液中葡萄糖含量的減少和乳酸生成的增多，及無氧代謝酶的活性增加等［8-9］。以上都進(jìn)一步證明HSP70的表達(dá)可以提高糖酵解水平，維持骨骼肌細(xì)胞能量代謝的平衡。

葡萄糖進(jìn)入骨骼肌細(xì)胞主要依賴葡萄糖載體的轉(zhuǎn)運，Glut4 是存在肌細(xì)胞內(nèi)和膜表面的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運體。研究證實，運動可以提高肌細(xì)胞Glut4蛋白的表達(dá)及轉(zhuǎn)位［10-11］，從而提高細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用。本實驗的結(jié)果也顯示，高表達(dá)HSP70能夠明顯提高骨骼肌細(xì)胞Glut4 蛋白的表達(dá)，提示HSP70 可以通過提高骨骼肌C2C12 細(xì)胞膜Glut4 的表達(dá)增加細(xì)胞對葡萄糖攝取。

綜上所述，過表達(dá)HSP70 的骨骼肌細(xì)胞可以通過提高肌細(xì)胞膜Glut4 的表達(dá)增加葡萄糖的攝取，并提高糖酵解相關(guān)酶的活性加速肌細(xì)胞糖酵解和提高細(xì)胞內(nèi)ATP 水平，維護(hù)細(xì)胞能量代謝的平衡。顯示HSP70 對細(xì)胞葡萄糖代謝的直接作用，但HSP70 調(diào)節(jié)細(xì)胞葡萄糖代謝的具體機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。

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