羅非魚水解蛋白金屬離子螯合物的抑菌活性研究

王子懷，胡 曉，李來好，楊賢慶，郝淑賢，吳燕燕，陳勝軍，岑建偉

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，國家水產品加工技術研發中心，廣東廣州510300；2.上海海洋大學食品學院，上海201306；3.中國科學院南海海洋研究所，廣東廣州510301）

羅非魚水解蛋白金屬離子螯合物的抑菌活性研究

王子懷1，2，胡 曉1，3，李來好1，*，楊賢慶1，郝淑賢1，吳燕燕1，陳勝軍1，岑建偉1

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，國家水產品加工技術研發中心，廣東廣州510300；2.上海海洋大學食品學院，上海201306；3.中國科學院南海海洋研究所，廣東廣州510301）

羅非魚肉蛋白經木瓜蛋白酶水解后分別與CaCl2、FeCl2按質量比（水解物∶金屬鹽）為5∶1、10∶1、20∶1進行螯合，研究并比較了羅非魚水解蛋白鈣、亞鐵離子螯合物的抗菌活性。結果表明：鈣、亞鐵離子與水解物的螯合率隨著水解物與金屬鹽質量比的升高而逐漸增大；氨基酸分析表明羅非魚肉蛋白水解物中具有金屬螯合活性的氨基酸含量較高，其占總氨基酸含量的34.59%；抑菌實驗顯示得到的螯合物對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長表現出明顯的抑制作用，其中以5∶1質量比得到的亞鐵離子螯合物的抑菌活性最高。

羅非魚水解蛋白，金屬離子螯合物，抑菌活性

我國羅非魚養殖產量位居世界首位，羅非魚資源極為豐富。目前，羅非魚的加工主要以凍全魚與凍魚片為主，而出口產品中以加工初級產品較多，深加工產品很少，大大限制了羅非魚蛋白的高值化利用。鈣和鐵都是人體必需的金屬元素，鈣一旦缺乏將影響機體發育并易造成骨質疏松等多種疾病；缺鐵易導致貧血和免疫力下降等疾病。人體對鈣、鐵的需求主要從食物中獲得，但其吸收過程及生物利用率受到多方面因素的影響。離子螯合肽是金屬離子按一定的摩爾比以共價鍵同肽類物質結合而成的有機物。鈣、鐵離子與肽螯合而形成有機態后，能夠借助肽在機體內的吸收機制提高其生物利用率[1-4]。研究發現，將具有抗菌活性或抗氧化活性的不同來源的蛋白質水解產物與一些金屬離子（如鈣、鐵、鋅、銅等）螯合后可以增強其生物活性[5-10]。因此，蛋白水解物與金屬離子的螯合物不僅可以作為一種金屬元素補充劑，又可作為食品、化妝品的添加劑，具有很大的研發價值。為提高羅非魚精深加工和綜合利用水平，尋求羅非魚肉蛋白新的利用途徑已成為目前的研究熱點，利用羅非魚肉蛋白制備抗菌活性肽是提高其生物效價的方式之一。縱觀國內外文獻資料，制備羅非魚水解蛋白金屬離子螯合物并探索其螯合率與抑菌活性關系的相關研究報道不多。本實驗以羅非魚肉為原料，采用酶法水解制備得到羅非魚肉蛋白水解物，將此水解物分別與鈣、鐵離子螯合后研究其抑菌活性，以期為具有抗菌活性的金屬離子螯合肽的研究與開發提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚 購自廣州華潤萬家超市，取羅非魚肉，絞碎，放置于聚乙烯袋內于-18℃凍藏備用；木瓜蛋白酶（實際酶活：264000U/g） 廣州齊云生物技術有限公司；氯化鈣、氯化亞鐵、氯化銨 均為分析純，廣州齊云生物技術有限公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，ATCC6633）、大腸桿菌（E.coli，ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）、技術瓊脂、營養瓊脂 廣東環凱生物科技有限公司；氨基酸標準品 Sigma。

DK-S24恒溫水浴鍋 上海信森實驗儀；普及型pH計 德國Sartorius公司；HJ-3恒溫磁力攪拌器 江蘇榮華儀器制造有限公司；3K30高速冷凍離心機 德國Sigma公司；AA240原子吸收光譜儀 美國Varian公司；Mars xpress微波消解儀 美國CEM公司；1100 series高效液相色譜 美國Agilent公司；PICO.TAG色譜柱 Waters，Milford，MA，USA；Transsonic T1-H-10超聲波清洗儀 德國Elma公司；Alpha1-4冷凍干燥機 德國Chaist公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅非魚肉蛋白水解物的制備 參考馬賽蕊等[11]方法，取羅非魚肉解凍后以1∶2（m/V）加入去離子水均質至混合物呈均一乳白色后，55℃恒溫水浴。待樣品中心溫度達到55℃后，添加木瓜蛋白酶，加酶量為0.3g/100g魚肉，攪拌酶解4h后沸水浴15min滅酶。冷卻后，于4℃、10000r/min離心20min后，抽濾得到的濾液即為酶解液。將酶解液凍干后即得到羅非魚肉蛋白水解物。

1.2.2 羅非魚肉水解蛋白金屬離子螯合物的制備 本實驗選取亞鐵、鈣兩種金屬離子與上述羅非魚肉蛋白水解物螯合并測定螯合物的螯合率。以CaCl2、FeCl2為金屬源，配制5mg/mL CaCl2、FeCl2溶液，稱取一定量的水解物溶于水中，室溫水化10min，然后按比例加入CaCl2、FeCl2（水解物與金屬鹽質量比為5∶1、10∶1、20∶1）于37℃水浴40min進行螯合反應。反應結束后將溶液全部移入透析袋透析并記錄透析后溶液的總膨脹體積，透析后溶液經冷凍干燥即得螯合物樣品。

1.2.3 螯合率測定 取上述透析后溶液5mL于消化管（經10%HNO3浸泡過夜并用去離子水洗凈），加入10mL濃硝酸和5mL去離子水后進行微波消解。取5mL消解液于100mL容量瓶（經10%HNO3浸泡過夜并用去離子水洗凈），以去離子水定容后用原子吸收法測定溶液中所含金屬離子的濃度C（mg/L），后經計算可得各螯合物的螯合率。

式中：C：為透析后金屬離子的濃度（mg/L）；V：為總膨脹體積（mL）；m：為加入金屬總質量（g）；n：為稀釋倍數。

1.2.4 螯合物的抑菌活性 參考張巖等[12]方法從4℃冰箱中取出的保藏菌株需經活化后使用，用接種環挑取適量菌苔在營養瓊脂斜面上劃線，37℃過夜培養。采用牛津杯雙層平板法檢測各螯合物抑菌活性，取5mL滅菌的2%瓊脂于培養皿中鋪平，待其凝固后擺放牛津杯，將1mL濃度為108CFU/mL測試菌液加入到滅菌后冷卻到46℃的營養瓊脂中，搖勻后適量傾倒入上述平板，待營養瓊脂凝固后用滅菌的鑷子小心取出牛津杯，向每個孔中分別加入一種螯合物水溶液（24mg/mL）150μL以測試各螯合物的抑菌活性，設置三個平行，以相同濃度（如5∶1質量比的螯合物相應的肽水解物濃度為20mg/mL）的肽水解物溶液作對照，以無菌水作空白，將培養皿小心移至恒溫箱37℃培養12h，觀察結果并測量抑菌圈直徑。

1.2.5 氨基酸分析 用6mol/L鹽酸于110℃處理樣品24h，使其充分水解，采用反相高效液相色譜（Agilent）及PICO.TAG柱（Waters），以異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相法[13]測定其氨基酸組成。其中色氨酸經堿解后測定，氨基酸標準品經過相同步驟處理后進行分析。

1.2.6 數據分析 實驗數據用平均值±標準差表示（n=3），采用SPSS16.0統計軟處理數據，應用t-test檢驗組間差異顯著性，p＜0.05表示組間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 螯合率測定結果

圖1 螯合率測定結果Fig.1 Chelation rate of the samples

本實驗中，羅非魚肉蛋白水解物與鈣離子和亞鐵離子按質量比（水解物∶金屬鹽）5∶1、10∶1及20∶1進行螯合。由圖1可知，鈣離子螯合物在5∶1、10∶1及20∶1的配比下的螯合率分別為44.82%、62.17%及71.88%；亞鐵離子螯合物的螯合率為40.49%、52.84%及60.72%。不同金屬離子與同種蛋白水解物的螯合率不同，相同質量比下，水解物與鈣離子的螯合率較亞鐵離子的高，說明相同條件下水解物更易與鈣離子發生螯合反應；而同種金屬在不同質量比下，螯合率隨著質量比升高而增大。

2.2 氨基酸分析結果

圖2 羅非魚蛋白水解物的氨基酸含量Fig.2 Amino acids content of tilapia protein hydrolysates

有研究表明，肽或蛋白的氨基酸組成及序列決定了其與金屬離子結合的效果，具有高含量谷氨酸和天冬氨酸殘基的肽或蛋白與金屬離子的結合效果較好，Asp-Glu-Asp和Glu-Glu-Glu可能是與金屬離子結合的關鍵序列[14-15]。幾種與金屬螯合活性較高的氨基酸已見諸報道，如組氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸[16]。本實驗中測得羅非魚肉蛋白水解物樣品中谷氨酸占17.28%，天冬氨酸占9.25%，組氨酸占3.38%，絲氨酸占3.58%，半胱氨酸占0.68%，這五種螯合活性較高的氨基酸占總氨基酸的34.59%，含量較高，這可能是羅非魚蛋白水解物具有較好螯合鈣、鐵離子能力的主要原因。此外，有報道認為半胱氨酸是影響蛋白水解物尤其是肉類蛋白水解物與亞鐵離子的螯合活性的重要氨基酸[17-19]，而Kroll[20]發現鈣離子與蛋白水解物的螯合活性與酸性氨基酸（Asp，Glu）上的羧基及組氨酸上的咪唑基團有關。本實驗中得到的羅非魚蛋白水解物中半胱氨酸（Cys）含量為0.68%，顯著低于酸性氨基酸（Asp，Glu）與組氨酸的含量，這與亞鐵離子螯合率較鈣離子螯合率低的結果相一致。

2.3 金屬離子螯合物抑菌活性

2.3.1 金屬離子螯合物對枯草芽孢桿菌的抑菌活性

由表1可知，以無菌水做對照，水解物對枯草芽孢桿菌未表現出抑制效果，其抑菌圈直徑小于無菌水可能由于是水解物無抑菌活性，但其本身作為營養物質又能被細菌利用助其生長所致。螯合物中，鈣離子螯合物與無菌水的抑菌活性沒有顯著性差異（p＞0.05），說明鈣離子螯合物不能抑制枯草芽孢桿菌生長；以質量比為5∶1得到的亞鐵離子螯合物抑菌圈直徑達13.14mm，抑菌作用明顯；三種亞鐵離子螯合物與無菌水的抑菌活性均存在顯著性差異（p＜0.05），說明三種亞鐵離子螯合物均能夠抑制枯草芽孢桿菌生長；此外，不同質量比得到的三種亞鐵離子螯合物的抑菌活性也有顯著性差異（p＜0.05），隨著質量比增大，所得螯合物的抑菌活性下降明顯，其原因可能是樣品中亞鐵離子的含量隨質量比增大而減少，故螯合物的抑菌效果反而降低。

表1 螯合物對枯草芽孢桿菌的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of the chelates against Bacillus subtilis

2.3.2 金屬離子螯合物對大腸桿菌的抑菌活性 表2中，水解物作為20∶1質量比得到螯合物的抑菌實驗對照組，其抑菌圈直徑與前兩次實驗呈顯著性差異（p＜0.05），這是由于實驗用牛津杯的直徑存在差別而造成的，對比其與無菌水的抑菌圈大小可知水解物對大腸桿菌無抑制效果。質量比為5∶1得到的亞鐵離子螯合物抑菌圈直徑達12.22mm，抑菌作用明顯，其與10∶1和20∶1質量比得到的亞鐵離子螯合物的抑菌活性差異顯著（p＜0.05）。以10∶1和20∶1質量比得到的亞鐵離子螯合物與無菌水的抑菌活性差異顯著（p＜0.05），但這兩種螯合物間的抑菌活性無顯著差異（p＞0.05），說明亞鐵離子與水解物在三種質量比下得到的不同螯合物均表現出對大腸桿菌的抑制活性，但隨著質量比增大，所得螯合物的抑菌活性顯著下降。鈣離子螯合物與無菌水間沒有顯著性差異（p＞0.05），說明其無抑菌效果。

表2 螯合物對大腸桿菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of the chelates against E.coli

2.3.3 金屬離子螯合物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性 由表3可知，水解物對金黃色葡萄球菌也未表現出抑制效果，鈣離子螯合物對金黃色葡萄球菌生長沒有抑制作用。以質量比為5∶1得到的亞鐵離子螯合物抑菌作用明顯，抑菌圈直徑為13.23mm，其與10∶1和20∶1質量比得到的亞鐵離子螯合物的抑菌活性差異顯著（p＜0.05）；以質量比10∶1得到的亞鐵離子螯合物有抑菌作用，其與無菌水的抑菌活性差異顯著（p＜0.05）；而以質量比20∶1得到的亞鐵離子螯合物未表現出抑菌活性且三種質量比下得到的不同螯合物的抑菌活性有顯著性差異（p＜0.05），表明亞鐵離子螯合物能夠抑制金黃色葡萄球菌生長，但隨著質量比的增大，所得螯合物的抑菌活性顯著下降。

表3 螯合物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of the chelates against Staphylococcus aureus

綜上所述，相同的細菌濃度下，亞鐵離子螯合物較鈣離子螯合物表現出更好的抑菌活性，其中以質量比為5∶1得到的亞鐵離子螯合物抑菌效果最好，初步分析可能是由于雖然質量比為20∶1得到的螯合物螯合率最高，但其樣品干粉中實際金屬含量較質量比為5∶1得到的螯合物少（1g以20∶1質量比得到的亞鐵離子螯合物干粉中金屬含量為0.03g，而5∶1的螯合物中金屬含量為0.07g），因此能與細菌細胞膜上各親疏水基團結合而造成其細胞膜損傷或代謝紊亂的金屬離子數量降低，抑菌活性隨螯合率上升反而下降。該螯合物對三種指示菌的抑制活性也有差異，對枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為13.14mm及13.23mm，高于大腸桿菌的12.22mm，而其中前兩者為革蘭氏陽性菌，后者為革蘭氏陰性菌，說明該螯合物對革蘭氏陽性菌的抑制效果可能要好于革蘭氏陰性菌。另外，對照無菌水可見該水解物的水溶液對三種指示菌未表現出抑菌活性，但在與亞鐵離子螯合后抑菌活性有所提高，說明羅非魚肉蛋白水解在與某些金屬離子螯合后能夠增強其抑菌活性。

3 結論

羅非魚肉蛋白水解物與鈣、亞鐵離子螯合的螯合率隨著水解物與金屬鹽質量比的升高而逐漸增大，最高可達71.88%。對酶解產物的氨基酸分析表明該水解物中具有金屬螯合活性的氨基酸占總氨基酸的34.59%，含量較高，這與螯合率較高的結果一致。比較此水解物與鈣離子和鐵離子的螯合物對相同濃度的指示菌的抑制效果，發現該蛋白水解物與亞鐵離子在特定條件下得到的螯合物對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長有明顯的抑制作用，不同螯合物間抑菌活性存在差異，其中以質量比為5∶1得到的亞鐵離子螯合物抑菌活性最高，對三種指示菌的生長都表現出一定的抑制效果，其原因可能是該質量比下制得的螯合物中金屬離子含量最高，因此更易造成細菌細胞損傷或代謝紊亂。

金屬離子螯合物作為一種新型金屬元素補充劑是時下的研究熱點，而以一些具有特殊生物活性的蛋白水解物與金屬離子進行螯合，則既可以達到補充金屬元素的效果，同時利用蛋白水解物的功能特性可使螯合產物成為一種天然無副作用的添加劑，應用于食品，飲料，藥品，化妝品等領域，大大增加了螯合物的用途和價值。在后續實驗中，期望摸索新的水解工藝以得到具有更高抑菌活性的蛋白水解物，優化螯合工藝以制備抑菌效果更好的螯合物，并探索螯合物結構與其抑菌活性間的關系。

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Antibacterial activity of tilapia protein hydrolysates chelated with metal ions

WANG Zi-huai1，2，HU Xiao1，3，LI Lai-hao1，*，YANG Xian-qing1，HAO Shu-xian1，WU Yan-yan1，CHEN Sheng-jun1，CENG Jian-wei1
（1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Key Laboratory of Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture，National R&D Center for Aquatic Product Processing，Guangzhou 510300，China；2.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；3.South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301，China）

Tilapia meat protein was hydrolyzed by papain and then the hydrolysates were chelated with CaCl2and FeCl2at the mass ratio（hydrolysate：mineral salt）of 5∶1，10∶1 and 20∶1，respectively.The antibacterial activity of the chelates was investigated.The result showed that the chelation rates were gradually increased with the increasing of the mass ratio.Amino acids analysis indicated that tilapia meat protein-hydrolysates had high content of chelating amino acids which accounted for 34.59%of total amino acid.Finally，antibacterial test showed that some chelates obtained under the certain conditions had significant antibacterial activity against Bacillus subtilis，Escherichia coli，and Staphylococcus aureus.The hydrolysate-ferrous ion chelate，which was obtained under the mass ratio of 5∶1，had the highest antibacterial activity against the three indicator bacterium.

tilapia protein hydrolysates；metal ion chelating；antibacterial activity

TS201.2

A

1002-0306（2014）08-0079-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.008

2013－06－17 *通訊聯系人

王子懷（1988-），男，碩士研究生，研究方向：食品科學與工程。

國家自然科學基金（31301454）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B06）；國家農業科技成果轉化資金項目（2010GB23260577，2010GB2E000335）；國家現代農業產業技術體系（CARS-49）；廣東省科技計劃重點項目（2011A020102005）；廣東省海洋漁業科技推廣專項（A201101C01）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目（2011TS01）。