微波加熱對牛乳清蛋白氧化的影響

肖 瀛，方雨婷，胡業芹，謝 凡，周小理，周一鳴，徐 迪

（上海應用技術學院，香料香精技術與工程學院，上海201418）

微波加熱對牛乳清蛋白氧化的影響

肖 瀛，方雨婷，胡業芹，謝 凡，周小理，周一鳴，徐 迪

（上海應用技術學院，香料香精技術與工程學院，上海201418）

本研究旨在探究普通加熱和微波加熱對牛乳清分離蛋白（WPI）氧化影響的差別。分別比較普通方式加熱15、30、60和90min以及微波加熱60、120、240和360s后WPI的羰基含量、巰基含量、二聚酪氨酸水平、表面疏水性、熒光光譜和SDS-PAGE電泳的變化。結果表明，與普通加熱相比，較長時間（＞120s）的微波加熱會使WPI的羰基含量、二聚酪氨酸含量明顯的增加，巰基含量明顯下降，表面疏水性與熒光光譜結果顯示長時間微波加熱可能對WPI結構有明顯修飾作用并改變其空間構象，SDS-PAGE結果顯示長時間微波加熱有明顯的交聯現象產生。

乳清分離蛋白，蛋白質氧化，微波加熱

加熱是食品加工過程中導致蛋白氧化的主要因素之一。近年來研究表明普通方式加熱可導致大豆蛋白、肉蛋白和乳蛋白等氧化，引起必需氨基酸減少、羰基含量增加、疏水性增加、促進蛋白交聯形成二聚體等結構改變，從而改變蛋白質理化特性和營養價值[1-4]。

微波加熱是家庭烹飪和食品工業廣泛使用的加熱方式，目前研究認為微波加熱對食物中蛋白質的含量影響不明顯[5]，很少有研究關注微波對蛋白結構的修飾作用。而微波非熱效應可加速有機反應速率，一些報道已顯示微波對酶蛋白質有改性作用，如微波加熱可改變α-淀粉酶的空間結構[6]，蛋白酶和脂肪酶經微波加熱后熒光和紫外光譜發生改變[7]。

乳清蛋白是一種營養豐富的重要食品組分，它被廣泛的使用以提高食品的品質和營養價值。本研究以牛乳清分離蛋白為研究對象，通過羰基含量、巰基含量、二聚酪氨酸含量、表面疏水性與熒光光譜分析，比較普通方式加熱和微波加熱對牛乳清蛋白氧化影響的差別。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

分離乳清蛋白（WPI） 純度＞92%，上海銳麟生物科技有限公司；2，4-二硝基苯肼（DNPH）、5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、8-苯胺-1-萘磺酸（ANS） 分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；牛血清蛋白 杭州百思生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒 碧云天生物技術研究所。

微波爐 廣東格蘭仕集團有限公司；UV-2102PC紫外可見分光光度計 上海壘固儀器有限公司；RF-5301 PC島津熒光分光光度計 日本島津科技有限公司；DYY-2C型電泳儀 北京市六一儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 WPI樣品處理 分別稱取約20g WPI四份置于直徑9cm平皿，放置于恒溫箱（溫度設置100℃）中加熱15、30、60、90min后分別取出，另取四份樣品于微波爐（功率設置為700W）中加熱為60、120、240、360s后分別取出。各組樣品取出后，立即使用熱紅外測溫儀（泰克曼TM950D）測定樣品，連續測定3次溫度取平均值。

2.4.2 非結構化數據挖掘能否實施。數據分析和數據挖掘在大數據中起到非常重要的作用，傳統的數據挖掘相對單一，滿足不了關系型數據和非結構化的數據，大數據是針對計算對象的數據處理，所以非結構化數據能正確的分析讀者的顯性行為和挖掘隱性行為，正式體現了大數據數據處理的優越性。

1.2.2 羰基含量的測定[8]用0.02mol/L pH6.0的PBS配制質量濃度為5.0mg/mL的WPI溶液，準確吸取0.45mL上述樣液于2mL塑料離心管，加入1mL的DNPH（濃度為10mmol/L），20℃水浴2h后，加入0.45mL質量分數為40%的三氯乙酸，劇烈振搖后靜置20min，10000r/min冷凍離心5min，棄去上清液，用1.5mL乙醇∶乙酸乙酯（1∶1，v/v）洗滌沉淀3次，加入1.5mL鹽酸胍溶液（6mol/L），37℃水浴20min，每隔5min劇烈振搖一次，在367nm處測吸光值。蛋白質濃度通過雙縮脲法測定。按式（1）計算羰基含量。

式中：A367：367nm處光程為1cm測得的吸光度；Mr：摩爾消光系數為22000M-1cm-1；c：蛋白質濃度（mg/mL）。

1.2.3 巰基含量的測定[9]用0.02mol/L pH6.0的PBS配制質量濃度為20mg/mL的WPI溶液，準確吸取1mL蛋白溶液與含有0.05mL的0.01mol/L DTNB的4mL磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH8.0）混合，劇烈振蕩后，25℃水浴20min，并每隔5min振蕩一次。用在412nm測定其吸光度。巰基含量按公式2計算。

式中：A412：412nm處光程為1cm測得的吸光度；Mr：摩爾消光系數為136000M-1cm-1；c：蛋白質濃度（mg/mL）。

1.2.4 二聚酪氨酸含量的測定[9]用pH為6.0濃度為0.02mol/L的PBS（含有濃度為0.6mol/L的KCl）配制質量濃度為0.3g/100mL WPI溶液。測定熒光強度，測量條件：激發波長（EX）：325nm，發射波長（EM）：420nm，狹縫寬度：10nm，熒光強度：低。最終的二聚酪氨酸（Dtyr）含量以測定熒光強度與蛋白濃度的比值表示，即相對熒光值，單位為arbitrary units（AU）。

1.2.5 表面疏水性的測定[9]稱取0.1g蛋白樣品溶于100mL 0.02mol/L pH6.0的PBS中，取上清液。用PBS稀釋至蛋白濃度在0.005～0.50mg/mL之間。取不同濃度的稀釋樣品4mL，加入40μL ANS溶液，測定熒光強度，測量條件：EX：390nm、EM：470nm、狹縫寬：10nm，熒光強度：低，以熒光強度對蛋白質濃度作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數。

1.2.6 內源性熒光光譜測量條件[10]EX：280nm，發射光譜掃描范圍：300～500nm，記錄范圍：0～250，熒光強度：低，掃描速度：中速。

1.2.7 激發光譜和發射光譜[10]激發光譜測量條件：EM固定在440nm，掃描范圍：220～400nm；發射光譜測量條件：EX固定在350nm，掃描范圍：400～600nm。熒光強度均設置為：高，掃描速度：中速。

1.2.8 SDS-PAGE凝膠電泳的測定 分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，開始電泳時電壓為80V，待樣品進入分離膠后改為100V；取出膠片經考馬斯亮藍染色30min，用甲醇-冰醋酸脫色液脫至透明。電泳膠片置于天能凝膠成像儀攝像。

2 結果與討論

2.1 加熱對WPI溫度的變化

表1 普通加熱與微波加熱對WPI溫度的影響Table 1 Effect of normal heat and microwave heat on temperature of WPI

本研究普通方式加熱的WPI置于恒溫箱（熱傳遞與熱輻射）進行15～90min加熱，由表1可知，普通方式加熱后，WPI溫度由20.3℃升高至61.2～94.6℃。而微波加熱的WPI則在較短加熱時間內（60～360s）溫度即可升高至55.9～95.4℃。微波加熱的原理不同于熱傳遞與熱輻射，微波使食品中的偶極分子（如水、蛋白質等）極性取向改變，其旋轉次數達數十億次秒，分子與分子之間急劇的摩擦、碰撞、振動、擠壓等的作用產生熱能，使物料內各部分在同一瞬間獲得熱量而升溫[5]。

2.2 加熱對WPI結構的影響

本研究通過比較不同加熱方式對WPI的羰基含量、巰基含量、二聚酪氨酸含量與表面疏水性的差別，分析微波加熱對WPI氧化的影響，結果見表2。

2.2.1 羰基與巰基含量的變化 羰基增多是蛋白質氧化重要的標志產物，而巰基氧化可轉變為二硫鍵[8-9]。隨著加熱的時間增加，WPI的羰基含量呈增加趨勢，而巰基含量呈現下降趨勢。短時間微波較普通加熱方式，在相近溫度樣品對應的羰基與巰基含量的差別不明顯，而長時間（＞120s）微波加熱對羰基與巰基影響較大，表明微波加熱對WPI有更強的氧化作用。

2.2.2 二聚酪氨酸含量的變化 酪氨酸聚合產物二聚酪氨酸（Dtyr）是蛋白經過自由基氧化修飾后一個有效的標志產物[1，9]，普通加熱過程中Dtyr含量呈現增加趨勢，加熱60min內，Dtyr含量明顯上升。微波加熱過程中Dtyr含量總體呈現更為明顯的增加趨勢，但短時間微波加熱對Dtyr產生的影響較弱。

2.2.3 表面疏水性的變化 疏水性可表征蛋白質的構象變化。本研究結果表明熱處理對蛋白質的疏水性有較強的影響。普通加熱15～30min內，WPI表面疏水性值隨時間增加明顯上升，然后緩慢下降。微波加熱后WPI表面疏水性變化趨勢基本與普通加熱方式相似，其變化程度更大，微波加熱時間120s內，其值呈上升趨勢，之后呈下降趨勢。疏水性的提高主要可能是因為熱變性導致埋藏在內部的疏水性殘基暴露到分子外部。隨著加熱時間的延長，其疏水性又開始緩慢下降，這很可能是氧化導致極性基團（如羰基等）增多與形成不可溶的蛋白聚集體導致的。

李竹青[11]與吳伶燕等[3]研究也發現加熱乳蛋白可導致羰基、Dtyr和表面疏水性顯著增多，巰基含量減少。另外研究報道蛋白質在熱變性過程中暴露出的基團還可以通過二硫鍵和各種次級鍵結合發生聚集[12]。但之前的研究均未涉及微波加熱的方式，本研究結果表明微波加熱較普通加熱方式對乳清蛋白的結構影響更為明顯。這可能與微波電磁波可引起分子的振動或轉動對化學鍵的斷裂做出貢獻以及微波對極性分子的熱效應明顯有關[13]。

表2 普通加熱與微波加熱對WPI結構的影響Table 2 Effect of normal heat and microwave heat on WPI structure

2.3 加熱氧化WPI的內源性熒光光譜

已有研究報道熱處理（普通加熱方式）對蛋白質構象有明顯的影響，可增加蛋白無序結構[12，14]。本研究為了進一步探究微波加熱對乳清蛋白的空間結構影響，進行了熒光光譜分析。

在280nm激發的蛋白樣品熒光發射光譜主要是由色氨酸和酪氨酸殘基所發射的，即內源性熒光光譜。由于其分子中從酪氨酸殘基到色氨酸殘基之間發生了能量轉移，從而導致了酪氨酸殘基的熒光熄滅和色氨酸殘基的熒光增加，其熒光峰是色氨酸殘基的熒光峰，其最大吸收波長（λmax）在325～350nm之間[15-16]。由圖1可見，微波加熱較普通加熱方式，其內源性熒光光譜變化程度更大。所有蛋白樣品λmax（333～335nm）基本沒有變化。短時間的微波加熱與普通方式加熱在此處熒光強度的增加，說明此時色氨酸殘基被氧化的程度較低，且有色氨酸殘基折疊暴露。而隨加熱時間增加，微波加熱360s的WPI的熒光強度明顯降低，表明此時色氨酸殘基被氧化的程度較高，位于蛋白質分子表面的色氨酸殘基減少。

2.4 加熱氧化WPI的激發光譜與發射光譜

圖2分別為普通加熱和微波加熱WPI的激發光譜，發射波長為440nm。激發光譜均有兩個峰，分別位于280nm和350nm附近；其中280nm附近的峰強度最大。相比之下，微波加熱后（360s）的WPI樣品的熒光光譜發生了明顯的變化，表現為激發光譜350nm附近的峰強度明顯增強，顯示加熱導致其的發色基團更為裸露[10]，即蛋白分子裸露程度變大。

圖1 普通加熱（a）與微波加熱（b）的WPI內源性熒光光譜Fig.1 Intrinsic fluorescence spectrum of the heated WPI by normal way（a）and microwave（b）

圖2 普通加熱（a）與微波加熱（b）的WPI激發光譜Fig.2 Excitation spectrum of the heated WPIin by normal way（a）and microwave（b）

圖3分別為普通加熱和微波加熱WPI的發射光譜，激發波長為350nm。樣品最大發射波長為440nm附近。普通加熱15min發射光譜基本不變，加熱30min發射光譜在440nm附近的峰強度明顯增加，加熱大于60min其增加趨勢又趨緩。而微波加熱的WPI發射光譜有較大變化，在440nm附近峰強度增加，長時間微波加熱（360s）發射光譜在440nm附近的峰強度則明顯增加，可能生成某些新的熒光物質[17]，此結果與羰基含量和二聚酪氨酸含量變化均一致。

圖3 普通加熱（a）與微波加熱（b）的WPI發射光譜Fig.3 Optical emission spectrum of the heated WPI by normal way（a）and microwave（b）

2.5 加熱氧化WPI的SDS-PAGE電泳

圖4 普通加熱與微波加熱對WPI結構影響的電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of the heated WPI by normal way and microwave

由圖4可見，未加熱WPI的SDS-PAGE結果有4條較清晰帶，即α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg）、免疫球蛋白（IgG）和牛血清白蛋白（BSA），以及隱約可見的β-乳球蛋白二聚體（β-Lg二聚體）。普通加熱隨著時間增加，交聯體條帶增多。短時間微波加熱聚合物形成相對不明顯，而隨微波加熱時間增加（120～360s），蛋白交聯聚合現象更為明顯增加，一些研究報道蛋白質氧化可發生蛋白質的聚集，導致降低消化道酶的對其的敏感性[18-19]。因此，本研究結果顯示長時間微波加熱可增加WPI中二聚體含量，可能降低人體對其消化利用率[14]。

3 結論

長時間（＞120s）的微波加熱WPI與普通方式加熱相比，可使其羰基含量、二聚酪氨酸含量明顯提高，而巰基含量明顯降低。長時間微波加熱WPI的表面疏水性與熒光光譜圖發生明顯的變化，可能與WPI結構修飾作用及空間構象變化有關。SDS-PAGE結果表明長時間微波加熱WPI的交聯產物（如β-乳球蛋白二聚體等）明顯增多。而短時間（＜120s）的微波加熱對WPI氧化影響的相對較小。本研究結果顯示應該合理地控制微波加熱牛乳及其制品的時間，減少氧化作用的產生，防止其營養價值的降低。

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Effect of microwave heat on the oxidation of whey protein

XIAO Ying，FANG Yu-ting，HU Ye-qing，XIE Fan，ZHOU Xiao-li，ZHOU Yi-ming，XU Di
（School of Perfume and Aroma Technology，Shanghai Institute of Technology，Shanghai 201418，China）

The aim is to investigate the different effects of the normal heating and microwave heating on the oxidation of whey protein.In this study，the whey protein（WPI）was normally heated for 15，30，60 and 90min，or heated by microwave for 60，120，240 and 360s.The heated samples were measured to compare the changes in fluorescence spectrum，carbonyl content，sulfydryl content，bityrosine level，surface hydrophobicity and SDSPAGE.The results showed that comparing with the normal heating，the long-term microwave heating obviously improved the carbonyl content and bityrosine level of WPI and decreases sulfydryl content.The results from surface hydrophobicity and fluorescence spectrum indicated that microwave heating had an obvious influence on the space structure of WPI.The SDS-PAGE suggestd that the microwave heating had obvious production of crosslinking of WPI.

whey protein isolation（WPI）；protein oxidation；microwave heating

TS201.2

A

1002-0306（2014）08-0105-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.014

2013－08－05

肖瀛（1981-），男，博士，副教授，研究方向：分子與應用營養學。

上海市教委優青基金（yyy11068）。