正交試驗優選灰兜巴粗多糖的提取工藝

謝美娜，范慧芬，陳朝喜，黃志宏

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

灰兜巴（HDB）又名閉口袋，是生長在海拔1 200多米以上的老茶樹叢內一種洞穴紅蜘蛛吐的絲巢，也有人認為是一種菌科植物[1-2]。趙勁航等人利用中藥復方灰兜巴灌胃治療糖尿病動物模型，發現該中藥可降低血糖濃度、抑制體重減輕、控制尿量增加和加速糖代謝作用[3]。孟凡欣、鄭丹等人的研究發現，灰兜巴多糖能夠降低糖尿病模型小鼠血糖濃度，同時降低血液中丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和尿素氮（BUN）含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）活性[4-6]。劉艷的研究發現，灰兜巴治療糖尿病的有效成分主要是多糖[7]。多糖提取方法主要有水提醇沉法、超聲波提取法、酶解法和超臨界流體萃取法等。酶解法操作較繁瑣，超臨界流體萃取法設備要求高，也不太適合強極性的多糖的提取[8]，超聲波提取法雖然提高了粗多糖提取率，但提取物所含固體雜質增多[9-10]。此外，上述3 種多糖提取方法不便于進行工業化生產。筆者選擇水提醇沉法提取灰兜巴粗多糖，結合灰兜巴粗多糖中多糖的含量測定，同時考察時間、溫度和料液比3 個因素，通過正交試驗選取最佳的提取工藝。

1 材料

灰兜巴購自四川省峨眉山市，晾干粉碎。95%乙醇、蒽酮等實驗試劑均為分析純。DU 800 可見-紫外分光光度計，美國貝克曼公司；旋轉蒸發儀RE-3000，上海亞榮生化儀器廠生產；Eppendorf 離心機5804R，德國艾本德公司等。

2 方法

2.1 灰兜巴粗多糖的提取方法 利用中藥多糖水提醇沉法，采用正交試驗對灰兜巴多糖水提條件進行優化，并確定最佳提取方法[11]。稱取粉碎后灰兜巴10 g 于三角瓶中，按照設計好的正交試驗條件水浴提取，然后以5 000 r/min 離心15 min，上清液減壓濃縮為原體積的2/5，在不斷攪拌下緩慢加入3 倍體積的95%乙醇，4 ℃靜置12 h，8 000 r/min（4 ℃）離心3 min，收集沉淀，經無水乙醇、丙酮、石油醚洗滌，再置于真空干燥箱干燥得到灰兜巴粗多糖。利用硫酸-蒽酮法測定灰兜巴粗多糖中多糖含量。

2.2 正交試驗 以溫度、時間和料液比3 因素，每個因素選取5 個水平，選用L25（56）正交試驗確定灰兜巴粗多糖最佳提取方法，水平因素見表1。

表1 正交試驗因素水平

2.3 灰兜巴多糖含量測定 試驗采用硫酸-蒽酮法檢測灰兜巴粗多糖中多糖含量[12]。

2.3.1 標準曲線制定 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖10 mg，溶于少量蒸餾水后定容到100 mL，制成100 μg/mL 葡萄糖溶液。

稱取0.2 g蒽酮溶于100 mL濃硫酸中制成2 g/mL蒽酮試劑。按表2 中順序加入各試劑，蒽酮試劑要緩慢加入并在冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中。水再次沸騰后計時準確煮沸10 min，自來水冷卻，室溫放置10 min，以0 號管為空白對照，于620 nm 比色。以吸光度A為縱坐標，以糖質量（μg）為橫坐標，制作標準曲線。

表2 硫酸-蒽酮法試劑

2.3.2 灰兜巴多糖質量測定 取灰兜巴多糖水提液1 mL 按2.3.1 中方法測吸光度，利用標準曲線查到多糖質量。由下面公式計算灰兜巴多糖提取率。

3 結果

圖1 葡萄糖標準曲線

3.1 葡萄糖標準曲線 葡萄糖標準曲線線性方程為y=0.0041x+0.0754，線性相關系數為0.9998，葡糖糖在0 到80 μg/mL 與吸光度線性關系良好。

3.2 正交試驗 利用L25（56）正交試驗，每個試驗平行3 次，以灰兜巴多糖提取率為結果。L25（56）正交試驗設計和結果見表3，對正交試驗進行方差分析結果見表4。從表3 中極差分析可知各因素對灰兜巴多糖提取率的影響順序為A(溫度)＞B(時間) ＞C(料液比)，說明溫度對灰兜巴多糖提取率影響最大，時間其次，最后是料液比，從表4 方差分析表中F 值可知溫度對多糖提取率影響顯著。由正交試驗結果均值可知最佳試驗組為A4B3C2，即最佳提取工藝是提取溫度90 ℃，提取時間為1.5 h，料液比為1∶10。

3.3 驗證試驗 以正交試驗所得的灰兜巴多糖最佳提取工藝來進行驗證試驗。3 次平行試驗結果平均值為1.305%，RSD值為0.575%（n=3），無顯著性差異。

表4 灰兜巴水提物正交試驗方差分析

4 討論

灰兜巴水煎液是四川峨眉地區治療糖尿病的一個民間偏方，且效果良好。趙勁航等人用灰兜巴治療鏈脲佐菌素或四氧嘧啶誘導的糖尿病大鼠和小鼠模型，通過對模型動物的血糖、耐糖量、尿量和體重測定，證實灰兜巴對糖尿病有治療作用[3]。孟凡欣的研究表明，灰兜巴多糖具有明顯的降糖作用，主要是通過清除體內氧自由基，降低MDA含量起到降糖作用[4]。但是關于灰兜巴治療糖尿病的具體機制尚不明確，是以后灰兜巴治療糖尿病的研究重點。

表3 灰兜巴水提物正交試驗設計和結果

本試驗利用傳統的多糖提取方法即水提醇沉法提取灰兜巴粗多糖，通過硫酸-蒽酮法檢測灰兜巴多糖含量。由硫酸蒽酮法標準曲線可知多糖在0～80 μg/mL 具有良好的線性關系。利用L25（56）正交試驗，通過溫度、時間和料液比3 個因素，每個因素5 個水平全面考察其對灰兜巴多糖提取率的影響。結果顯示，試驗組A4B3C2 的多糖提取率最高，即最佳提取工藝是提取溫度為90 ℃，提取時間為1.5 h，料液比為1∶10。以提取溫度90 ℃，提取時間1.5 h，料液比1∶10 的最佳工藝進行3 次驗證性試驗，所得結果無顯著性差異，可知該最佳提取方法穩定可行。

陳燕忠等提取灰兜巴多糖試驗中，未考察溫度因素[11]。張琳華[12]、林志鑾[13]和劉長建[14]等人在研究中藥多糖提取工藝時，均以溫度做為一個考察因素，結果也顯示溫度在正交試驗中比其他因素影響顯著。溫度對多糖提取影響顯著，可能是溫度過低造成多糖提取不充分，溫度過高可以破壞多糖化學結構，從而影響多糖提取率和藥物效果。本試驗中選擇提取溫度、提取時間、料液比3個因素，每個因素設5 個水平，全面考察溫度、時間、料液比對灰兜巴多糖提取率的影響，為以后對灰兜巴多糖的進一步研究奠定基礎。

目前，多糖提取方法主要包括水提醇沉法、超聲波提取法、酶解法和超臨界流體萃取法等。多糖超聲波提取法比水提醇沉法所得固體量較多，但是多糖提取量沒有增加，可能因提取過程復雜，所得雜質增多，且超聲波提取法沒有水提醇沉法提取工藝成熟[9-10]。酶解法可以縮短多糖提取時間，增加多糖提取率，但是酶解法生產成本較高，操作較為繁瑣[15]。超臨界流體萃取技術具有提取率高的特點，所以在中藥提取中應用越來越廣泛，但是該技術對設備要求較高，也不適合強極性物質的提取[8]。本試驗選擇恒溫水浴條件下，利用水提醇沉法提取灰兜巴粗多糖，該方法有耗時較長、消耗溶劑較多的缺點，但其工藝較為成熟，便于進行工業化生產。

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