乳腺癌轉移抑制因子(BRMS1)在人乳腺癌細胞系中的表達受體研究

張雨祿， 胡三元

(山東大學醫學院 山東濟南250012)

0 引言

近年來，隨著腫瘤分子生物學研究的進展，腫瘤轉移抑制基因逐漸被認識并且成為研究的熱點．研究認為，腫瘤轉移抑制基因在轉移腫瘤中呈低表達，而在非轉移腫瘤中呈高表達，因此認為其能參與腫瘤的轉移途徑而起到抑制腫瘤轉移的作用．乳腺癌轉移抑制因子(breast cancer metastasis inhibitory factor 1，BRMS1)是2000年新發現的定位于人11號染色體的腫瘤轉移抑制基因，已被證明在不同類型的腫瘤中有表達，包括非小細胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、乳腺癌等，并且能通過抑制腫瘤的遷移、侵襲等抑制腫瘤的遠處轉移［1－2］．近年，亦有學者研究BRMS1在乳腺癌轉移中的作用，但BRMS1在人乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達研究甚少．本文通過分子生物學方法研究BRMS1在人乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達，旨在發現BRMS1在人乳腺癌細胞系的受體基因序列，為研究者進一步研究BRMS1在人乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中的生物學功能提供依據，為臨床醫師從基因學角度對人乳腺癌進行治療及預防其遠處轉移提供參考．

1 材料和方法

1．1 材料

細胞系:人乳腺癌細胞系:MDA MB-231和MCF-7從歐洲動物細胞培養機構購買(ECACC，英國)，在37℃潮濕的5%CO2培養箱中培養．野生型(MDA231WT，MCF-7WT)細胞在普通培養液中培養:10%胎牛血清(FCS)+ABS(氨芐青霉素，兩性霉素B，鏈霉素)．配比方法:用50 mL的胎牛血清，3．3 g氨芐青霉素，12．5 ng兩性霉素B和5 g鏈霉素，配置在500 mL 0．4%酚紅溶液中．質粒(MDA231PEF，MCF-7PEF)在維持培養液中培養(在普通培養液中加入27．5 μL Blasticidin)．

材料:進行PCR所用引物及核酶都是從Sigma-Aldrech公司(英國)購買(引物序列見表1)．PCR混合物從Sigma-Aldrich公司(英國)購買．反轉錄試劑盒是由美國應用生物系統公司提供．除非另有說明，所有其他化學品均購自Sigma-Aldrich公司．

1．2 方法

1．2．1 轉化

質粒(MDA231PEF，MCF-7PEF)被克隆到大腸桿菌中并進行重構，通過PCR實驗選擇正確的質粒結構并進行擴增．用基因質粒提取試劑盒(Sigma-Aldrich，美國)進行純化．

1．2．2 RNA 提取、反轉錄

在RNA提取實驗中，用TRI反應物(T9424-200 ML，Sigma-Aldrich，美國)，按照說明書的參考步驟，對MDA MB-231和MCF-7細胞系進行RNA提取，然后用分光光度計(WPA紫外分光光度計，英國)對RNA進行定量．使用iScript cDNA分析儀(AB Applied Biosystems，Thermal Cycler，新加坡)進行反轉錄實驗，將RNA反轉錄成cDNA．

1．2．3 BRMS1 部分基因敲除實驗

為達到BRMS1的核酶轉基因目的，使用核酶及相應PCR引物，通過PCR實驗將BRMS1部分基因敲除，所用引物組為BRMS1rib1F/R．PCR反應條件如下:72℃ 10個循環，68℃ 10個循環，64℃ 10個循環，60℃10個循環，55℃ 20個循環，將PCR產物在大腸桿菌中進行克隆與增殖．為了驗證正確序列的核酶轉基因產物，進行了PCR驗證實驗，引物組T7F+RBBMR作為陰性對照組，引物T7F+RBTPF為陽性對照組(所用引物序列見表1)，通過PCR測序及克隆分析，對正確的轉基因序列克隆組進行擴增、純化及提取．將基因部分敲除的BRMS1重命名為MDA231BRMS1rib1和MCF7BRMS1rib1．

1．2．4 聚合酶鏈反應(PCR)

將MDA MB-231和MCF-7細胞系的cDNA作為模板進行PCR實驗，所用PCR儀器為T-Cy Thermocycler(AB Applied Biosystems，Thermal Cycler，新加坡)，所用PCR反應混合物為Taq Green，2×反應混合物．PCR條件如下:94℃、30 s變性過程，55℃、40 s退火過程和72℃、1 min擴增過程，分別設置25、30和35個循環．把PCR產物在1% 瓊脂糖凝膠、100 V電壓下進行電泳30 min．用Sybr Safe DNA膠染色劑(Invitrogen，Molecular Probes，美國)染色40 min，最后在一個超亮LED藍色顯影儀(Syngene，U:Genius 3)顯示下采集圖片．

表1 實驗中所用引物Tab．1 Primers in assays

2 結果

2．1 BRMS1及其受體在乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中均有表達

為研究BRMS1及其受體在乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達，進行了PCR實驗．實驗設3－磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)F8/R8對照組及引物R8/F8和R9/F9組．結果顯示，BRMS1及其受體在乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中均有表達，但BRMS1及其受體在引物F9/R9組中的表達比引物F8/R8組中表達更強，如圖1所示(PCR實驗重復3次)．

圖1 BRMS1及其受體在人乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7的表達Fig．1 Expression of BRMS1 in human breast cancer cell lines of MDA MB-231 and MCF-7

2．2 部分基因敲除的BRMS1(MDA231BRMS1rib1，MCF7BRMS1rib1)及其受體在乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達減弱

用PCR實驗研究BRMS1部分基因敲除后(MDA231BRMS1rib1，MCF7BRMS1rib1)在人乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達．結果顯示，BRMS1部分基因敲除后(MDA231BRMS1rib1，MCF7BRMS1rib1)在人乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中表達減弱，見圖2(PCR實驗重復3次)．

圖2 BRMS1部分基因敲除后在人乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中表達減弱Fig．2 Expression of BRMS1 with part genes knocked down was weakened in the human breast cancer cell lines of MDA MB-231 and MCF-7

3 討論

最近的許多研究都集中在惡性腫瘤轉移的分子機制上，如對腫瘤轉移抑制基因的研究，近幾年報道，轉移抑制基因主要影響腫瘤轉移的過程，而不是影響癌細胞的增殖［2－3］．乳腺癌轉移抑制因子1(BRMS1)就是一個具有轉移抑制活性的因子，BRMS1是轉移抑制基因家族中的一個重要的家庭成員，它能抑制腫瘤的轉移但不阻斷腫瘤的生長［4－5］．研究報道，BRMS1能明顯降低無胸腺小鼠來自于卵巢癌、黑色素瘤及乳腺癌的腫瘤細胞的肺轉移［1，6］，證實了BRMS1存在于卵巢癌、黑色素瘤及乳腺癌的組織中，并且抑制腫瘤細胞的遠處轉移．研究發現，在乳腺癌腦轉移中，BRMS1的mRNA表達水平低于原發腫瘤，并且與相匹配的正常乳腺組織相比，BRMS1在乳腺腫瘤中含量降低［7－10］．盡管BRMS1已被證實在抑制乳腺癌的遠處轉移中起到一定的作用，但其作用機制及參與途徑仍不是很明確，BRMS1在人乳腺癌細胞系MDA MB-231及MCF-7中的表達及其受體仍不是很清楚．因此，發現BRMS1在人乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中的受體基因序列，對于進一步研究BRMS1在人乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中的生物學功能，以及從基因學角度對人乳腺癌進行治療及預防其遠處轉移具有重要意義．

本研究通過PCR實驗方法，從分子生物學水平上證實了BRMS1及其受體在人乳腺癌細胞系MDA MB-231及MCF-7中均有明顯的表達，從而發現BRMS1在人乳腺癌細胞系MDA MB-231及MCF-7中的受體基因序列．從圖1中可以看出，在引物組F8/R8及F9/R9的PCR反應中，BRMS1在MDA MB-231及MCF-7細胞系中均有表達，但在引物F9/R9的反應中表達增強，提示引物F9/R9所對應的基因序列與BRMS1在MDA MB-231及MCF-7細胞系中的受體序列吻合度較高．通過酶切反應將BRMS1部分基因敲除后，BRMS1在人乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達也有相應的減弱，如圖2所示，提示核酶BRMS1rib1F/R的基因序列能成功地將BRMS1的部分基因敲除，從而為進一步研究BRMS1在人乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7的功能試驗提供正確的基因序列．

在今后的研究工作中，在發現BRMS1在人乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達及其受體的基礎上，進一步進行生物功能試驗，研究BRMS1在人乳腺癌細胞系MDA MB-231和MCF-7的生長、遷移、侵襲等方面的作用，為乳腺癌的臨床治療提供分子生物學技術．通過增強BRMS1在人乳腺癌中的含量及作用，達到抑制乳腺癌細胞遠處轉移的目的，從而減少乳腺癌的轉移率，提高患者的長期生存率．

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