四神丸對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織病理形態及血清抗炎、促炎因子平衡的影響*

王 燕，朱向東，段永強，李蘭珍，曹燕飛，汪 斌

(甘肅中醫學院中醫基礎理論教研室，甘肅 蘭州730000)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是以腹瀉、腹痛、黏液膿血便為主要臨床癥狀，以結腸黏膜慢性炎癥和潰瘍形成為病理特點的一種慢性疑難腸病。該病治愈難度大，且愈后易復發［1-2］。由于UC 的發病機制尚不十分明確，現代醫學缺乏特異性治療藥物。四神丸主要由肉豆蔻、補骨脂、吳茱萸、五味子組成，具有溫腎健脾、止瀉固腸的功效。諸多醫家臨床上常以四神丸加減治療潰瘍性結腸炎，療效確切，但作用機制不清。本研究建立UC 大鼠模型，研究四神丸對實驗性UC 大鼠結腸組織病理形態變化及血清中抗炎因子(IL-10)、促炎因子(IL-2、IL-6)平衡的影響，以探討四神丸治療UC 的作用機制，為該方的臨床廣泛運用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF 級Wistar 大鼠40 只，體質量(180 ±10)g，雌雄各半，由甘肅中醫學院科研實驗動物中心提供，SPF 級實驗設施合格證號為SYXKC(甘)2004 -0006 -0001561，SPF 級動物質量合格證號為SCXKC(甘)2004 -0006。

1.2 藥品、試劑與儀器

四神丸，由甘肅中醫學院附屬醫院藥劑室制備。按照原方2∶4∶2∶1∶2 比例取肉豆蔻、補骨脂、五味子、吳茱萸、大棗，用8 倍量700 g/L 的乙醇每次回流2 h，提取3 次，得醇提取液和醇提取藥渣。合并3 次醇提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇后得醇提取濃縮液，干燥得干膏，將干膏粉碎成細粉，加入揮發油。實驗用不含賦形劑的浸膏，4 ℃冰箱保存備用。柳氮磺吡啶(SASP)，0.25 g/片，上海三維制藥有限公司產品，批號H32020026。2，4，6 -三硝基苯磺酸(TNBS)，購于北京邦定泰克生物技術有限公司，由美國Sigma 公司生產，批號為2008 -16 -2;蛋白標準液、考馬斯亮藍溶液(20090825)，均購自南京建成生物工程公司;大鼠IL-2、IL-10、IL-6 檢測試劑盒，購自深圳市達科為生物技術有限公司。CT14RD高速冷凍離心機，天美科技有限公司產品;Bio -Rad iMark 酶標儀，美國BLO-RAD 公司產品;303 -2 型恒溫培養箱，北京科偉永鑫實驗設備儀器公司產品。

1.3 模型的建立

［1 -3］方法，采用TNBS/乙醇方法建立大鼠UC 模型。將Wistar 大鼠40 只，實驗前禁食24 h，自由飲水，以100 g/L 水合氯醛腹腔麻醉后，一次性將TNBS/乙醇液(100 μg/g TNBS +500 g/L 的乙醇0.25 mL)用橡膠輸液管輕緩注入大鼠距肛門7 ～8 cm 深的腸腔內，捏緊肛門倒置10 min 即可。空白對照組10 只大鼠采用同樣方法用等量的生理鹽水灌腸。

1.4 動物分組與給藥

將動物分為空白對照組、模型對照組、四神丸組及SASP 組4 組，每組10 只。除空白對照組外均以100 μg/g TNBS 加500 g/L 乙醇0.25 mL 混合試劑灌腸。給藥量按體表面積換算:四神丸組給予四神丸浸膏劑5 g/kg 灌胃，SASP 組按0.3 g/kg 劑量灌胃。灌胃體積均為10 μL/g，空白對照組、模型對照組灌服等體積生理鹽水。各組于造模后第2 天開始灌胃，每日1 次，連續21 d。

1.5 檢測指標

1.5.1 標本的采集

3 周后，脫頸處死大鼠，乙醚麻醉后于股動脈采血，室溫靜置10 ～20 min，3 000 r/min 離心10 min，收集上清，備檢。剪取病變最明顯處結腸組織5 ～8 cm，用冷PBS 緩沖液清洗結腸，部分結腸組織以40 g/L 中性多聚甲醛固定，做病理切片，HE 染色，光鏡觀察。

1.5.2 結腸組織病理形態及其評分

參考結腸病理組織學評分標準［4］，由兩位富有經驗的病理教研室老師進行雙盲評分。炎細胞浸潤:無0 分，輕度1 分，重度2 分。浸潤深度:黏膜層1 分，黏膜和黏膜下層2 分，結腸全層3 分。潰瘍深度:無0 分，上皮1 分，黏膜固有層2 分，黏膜肌層3 分。

1.5.3 IL-10、IL-6、IL-2 含量

采用雙抗體夾心ELISA 法測定IL-10、IL-6、IL-2含量，嚴格按試劑盒要求操作。從冰箱取出大鼠血清;取出酶標板，依照次序對應分別加100 μL 的標準品于標準品孔中;分別標記樣品編號，加100 μL樣品于樣品孔中;在對照品孔和樣品孔中加50 μL的酶標記溶液;37 ℃孵育反應90 min;手工洗板6 次，每次靜置25 s;將100 μL/well 加入TMB 顯色，37 ℃避光溫育30 min;將100 μL/well 迅速加入終止液終止反應;10 min 內放入酶標儀中用雙波長即檢測波長450 nm 和校正波長620 nm 同時讀板，采集實驗數據，制作標準曲線，計算各樣本含量。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計分析軟件處理。計量資料數據以均數(x-)± 標準差(s)表示，組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況對比

模型對照組大鼠在造模當天開始出現覓食不主動，食量減少，稀便，肛周污濁，體質量略有下降，毛色晦暗無光澤，肛門處有糞便沾染，部分大鼠出現血便。四神丸組、SASP 組隨著給藥時間的持續，上述表現明顯好轉，部分大鼠稀便消失，糞便呈灰褐色顆粒狀，毛色逐漸轉為光亮潤澤，食量正常，活躍，體質量略有增加。

2.2 各組大鼠結腸組織病理形態對比

模型對照組大鼠結腸組織有較大潰瘍，潰瘍深度大多至黏膜肌層，有明顯的炎細胞浸潤，且浸潤深至黏膜全層，可見血管擴張充血，有糜爛，黏膜上皮層有缺失，固有層腺體明顯減少及破壞，黏膜下層部分可見血管增生。兩個治療組大鼠的結腸組織病理形態有程度不同的改善，其中四神丸組潰瘍基本愈合，腺體增生愈合，有明顯的愈合面存在。見圖1。結腸病理組織學評分結果見表1。

圖1 各組大鼠結腸組織病理形態(HE，10 ×)

表1 各組大鼠結腸組織病理學變化及血清IL-2、IL-10、IL-6 含量對比 n=10，μg·L -1±s

表1 各組大鼠結腸組織病理學變化及血清IL-2、IL-10、IL-6 含量對比 n=10，μg·L -1±s

注:與空白對照組對比，* P ＜0.01;與模型對照組對比，# P ＜0.05，## P ＜0.01。

組別 劑量/(g·kg -1) 病理組織學評分IL-2 IL-10 IL-6空白對照組 0 0.75 ±0.64 28.04 ±9.77 53.97 ±11.38 177.25 ±38.65模型對照組 0 7.10 ±1.19＊＊ 43.05 ±8.42＊＊ 23.47 ±7.66＊＊ 248.05 ±46.56＊＊四神丸組 5 4.17 ±1.40## 28.57 ±2.12## 41.36 ±8.04## 183.50 ±17.74##SASP 組 0.3 3.81 ±0.78## 30.26 ±2.94## 42.36 ±12.51## 193.84 ±44.06#

2.3 各組大鼠血清IL-2、IL-10、IL-6 含量對比

與空白對照組對比，模型對照組大鼠血清IL-2、IL-6 含量增高，IL-10 水平降低，差別有統計意義(P ＜0.01)。與模型對照組對比，四神丸、SASP 組的IL-2、IL-6 含量均降低，差別有統計意義(P ＜0.01或P ＜0.05);IL-10 水平升高，差別有統計意義(P ＜0.01)。見表1。

3 討 論

UC 發病率高，危害大。反復發作的炎癥性腸病多累及直腸和遠端結腸，是一種病因不明的慢性腸道炎癥，以潰瘍、糜爛為主要臨床表現，作為炎癥性腸病的一種，已被世界衛生組織列為消化系統的疑難病［4］。臨床治療目前是以皮質類固醇類和氨基水楊酸類等藥物為主，然而這兩類藥物均存在長期服藥副作用多、停藥后易復發、患者耐受性差等問題，故從中醫藥領域探索更為理想的治療藥物已成為近期的研究重點。UC 類似于中醫學的“痢疾”“休息痢”“泄瀉”“便血”“腸風”等病。有研究通過規范專家經驗辨證，提取證候要素，總結UC 的常見證候及其證候要素的分布特點，發現脾腎陽虛證是UC 的常見和重要證候［5］。溫腎健脾法是重要的治法，臨床多選治療五更瀉的名方四神丸化裁加減治療，療效顯著，但作用機制不明。參與炎癥反應的細胞因子一般分為促炎和抗炎兩類，在UC 發病機制研究中，促炎細胞因子與抗炎細胞因子之間的平衡失調被視為是導致UC 的重要原因。UC 的發生機制不僅涉及黏膜局部免疫紊亂，同時也與全身免疫功能失調密切相關。

IL-2 作為重要的促炎細胞因子，與B 細胞、T 細胞、單核細胞表面的IL-2 受體結合后，能引起T 細胞增殖、活化、增強NK 細胞活性、促進細胞毒T 細胞的殺傷作用，因此對于免疫調節有重要意義。有研究表明:［6］IL-2 基因敲除小鼠會發生與人類UC 相似的結腸炎癥。臨床研究［6］顯示:UC患者IL-2 水平降低，表明IL-2 在UC 發病中起著重要的作用。IL-10 是典型的抗炎與免疫抑制性細胞因子，它的缺失能導致自發性的由Th1 T 細胞介導的類似于CD 的結腸炎［7］。研究發現:IL-10是具有多重功效的炎癥抑制因子，其主要生物學活性是免疫抑制作用，能抑制IL-6、TNF-α、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等的產生［8］。動物實驗發現:IL-10 基因缺陷小鼠在無特異性致病菌的普通動物飼養條件下能自發慢性非感染性腸道炎癥［9］，說明IL-10 在維持正常腸道黏膜免疫系統調節中發揮重要的作用［10］。

IL-6 是由單核巨噬細胞產生的多向性的細胞因子，可介導免疫球蛋白的分泌，同時也可提高T 細胞的活化信號及促進細胞毒T 細胞、NK 細胞溶解細胞的能力。有研究［11-12］發現:UC 患者的血清IL-6濃度明顯升高，且與病變范圍和病變嚴重程度成正相關。本研究表明:模型對照組大鼠血清促炎細胞因子IL-2、IL-6 的含量均明顯高于空白對照組，而抗炎細胞因子IL-10 的含量則明顯低于空白對照組，說明抗炎和抑炎細胞因子的失衡參與了UC 的發病。經過四神丸治療后，實驗大鼠血清IL-2、IL-6含量均顯著降低，而IL-10 含量顯著升高。此表明:四神丸治療UC 的機制之一可能是通過抑制促炎因子IL-2、IL-6 的表達，提高抗炎因子IL-10 的含量，進而調整了抗炎因子與抑炎因子的平衡，糾正了腸道異常免疫反應，從而使腸黏膜組織修復，炎癥和潰瘍消除。病理組織學檢查結果與評分也與上述結論一致。

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