轉玉米PEPC基因水稻的形態和光合酶活性變化

李萬昌+王丹+王俊偉+姬生棟

摘要：以穩定的轉PEPC基因水稻和未轉PEPC基因水稻為供試材料，對其外形和光合酶活性進行測定。結果表明，與未轉PEPC基因水稻相比，轉PEPC基因水稻株高增加、莖稈變粗、葉片變寬、根系發達，光合酶活性增加，且產量構成因素均增加。

關鍵詞：水稻；PEPC基因；光合酶活性

中圖分類號：S511.036 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0023-02

Morphology and Photosynthetic Enzyme Activity of Maize PEPC Transgenic Rice

LI Wan-chang，WANG Dan，WANG Jun-wei，JI Sheng-dong

（College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China）

Abstract： The agronomic traits and photosynthetic enzymes activity were studied in maize PEPC transgenic rice and the untransformed rice. The results showed that the plant height was higher， the stalk was stronger， the leaf was wider， the root system was more exuberant than that of the untranformed rice. The photosynthetic enzyme activity was increased and the yield components were improved in PEPC transgenic rice.

Key words： rice； PEPC gene； photosynthetic enzyme activity

收稿日期：2013-04-07

基金項目：河南省科技攻關項目（102102310318）；國家自然科學基金項目（1304317）

作者簡介：李萬昌（1974-），男，河南汝州人，副教授，博士，主要從事作物遺傳育種研究，（電話）13264591533（電子信箱）li_wan_chang@163.com。

葉片經強光照射導致光合效率長期降低的現象稱為光抑制，在C3植物中有較高的光呼吸，光抑制是普遍現象，水稻的光抑制現象經常發生。而C4植物同化CO2的途徑為C4光合途徑，具有濃縮CO2的機制，特別在高光、高溫和干旱條件下，具有較高的光合能力和養分利用效率。因此，將C4植物的光合基因轉入C3植物水稻中以提高其光合能力的研究備受關注[1]。早期人們曾試圖用常規雜交的方法將C4植物的性狀轉移到C3植物中[2]， 但未獲得成功。近年來，隨著分子生物學技術的發展，用農桿菌轉化系統將轉磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）導入水稻，獲得了一些高表達的轉基因水稻植株[3，4]。本試驗以未轉PEPC基因水稻和高表達轉PEPC基因水稻為材料，對轉基因水稻的外形和光合酶活性的變化進行研究，為應用生物技術進行水稻的遺傳改良提供依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以粳稻品種新稻18為基因受體，導入玉米的PEPC基因，獲得不同的轉基因水稻材料，這些材料盆栽于河南師范大學水稻育種試驗地，在自然溫光條件下按常規管理。

1.2 酶液的提取和酶活性的測定

取水稻葉片2 g 在Tris-HCl 緩沖液中冰浴研磨，8 層紗布過濾后，將濾液在低溫高速離心機上于4 ℃下10 000 g離心20 min，棄沉淀，上清液即為酶液。C4 光合酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）的酶活測定參照Gonzalez等[5]的方法，碳酸酐酶（CA）活性測定按照郭敏亮等[6]的方法，NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）的活性測定參照李斌等[7]的方法，RuBP羧化酶（RuBPC）活性的測定參照Kung等[8]的方法。

2 結果與分析

2.1 供試材料的形態比較

將玉米的PEPC基因導入水稻后，獲得了一系列形態各異的轉基因株系。與對照新稻18相比，轉基因株系的株高變高，根系發達（圖1），葉片變寬，莖稈變粗（圖2）。轉基因株系的單株有效穗數、穗長、千粒重和單株產量與對照相比分別提高了30.2%、7.5%、8.9%和32.1%。可見外形的變化和產量構成因素的增加密切相關。

2.2 轉基因水稻與對照葉片光合酶活性的比較

在正常光照條件[光照350 μmol/（m2·s），21% O2，350 μL/L CO2，30 ℃，3 h]下，測定了對照和轉基因株系的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、碳酸酐酶（CA）、NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）和RuBP羧化酶（RuBPC）的活性。發現轉基因株系PEPC的活性明顯高于對照，而CA、NADP-MDH和RuBPC的活性與對照相近（圖3A）。在光抑制條件[光照1 000 μmol/（m2·s），2% O2，60 μL/L CO2，30 ℃，3 h]下，轉基因株系中RuBPC的活性與對照相比增加了5%左右（兩者差異不顯著），而轉基因株系中PEPC、CA和NADP-MDH的活性比各自對照分別增加了282.3%、23.1%和25.6%（圖3B）。說明在光抑制條件下，轉基因水稻中除了PEPC活性增加外，其他C4光合酶也誘導增加，并且高于各自對照。可見，轉基因株系中，不論何種條件下，PEPC的酶活都高于對照，可以大大提高光合效率。

3 討論

長期以來人們對C3植物中是否存在C4光合途徑一直持懷疑態度，因為C4植物葉片具有特殊的Kranz結構，而C3植物中沒有這樣的結構。但早有報道在C3作物大豆[9]、小麥[10]、水稻[11]葉片中有C4光合酶系統。將C4循環酶基因導入C3作物被認為是提高作物光合效率和發揮產量潛力的重要途徑。陳根云等[12]的研究發現，向C3植物菠菜中外加C4光合原初產物草酰乙酸或蘋果酸可提高葉片的光合能力，為在C3植物中建立C4微循環系統來提高光合效率的可能性提供了依據。

常規育種→生理育種→生物技術育種是作物育種的發展趨勢[13]，其中高光效生理育種是當代植物生理和育種工作者共同關注的問題，特別是C3植物中增加C4光合能力的研究引人注目[14，15]。為探明水稻中C4微循環及其生理功能，將玉米的高光效基因PEPC導入到新稻18中，獲得了一系列株高增加、根系發達、葉片變寬、莖稈增粗的轉基因株系。與對照相比，這些轉基因株系的生物學產量和經濟產量均增加，并且其光合酶活性也大大增強，這與焦德茂等[16]的研究結果一致。周寶元等[17]研究發現PEPC過表達可以減輕干旱脅迫對水稻光合作用的抑制；丁在松等[18]研究發現干旱脅迫下PEPC過表達增強水稻的耐強光能力，這和本研究轉基因植株的根系發達、莖稈增粗的形態變化相一致。轉基因株系的外形變化可能是轉PEPC基因水稻抗逆增產的生理基礎。因此，在現有良好株型和雜種優勢利用的基礎上，通過遺傳操作將C4光合酶基因導入我國高產水稻品種中，將開拓一條新的水稻育種途徑。

參考文獻：

[1] MATSUOKA M， FURBANK R T， FUKAYAMA H， et al. Molecular engineering of C4 photosynthesis[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52：297-314.

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[6] 郭敏亮，高煜珠，王 忠.用酸度計測定植物碳酸酐酶活性[J].植物生理學通訊，1988（6）：59-61.

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[8] KUNG S D，CHOLLET R， MARSHO T V. Crystallization and assay procedures of tobacco ribulose 1，5-bisphosphate carboxlase-oxygenase[A]. PIETRO A S. Method in Enzymology[C]. New York： Academic Press Inc，1980.

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[10] HATA S， MATSUOKA M. Immunological studies on pyruvate orthophosphate dikinase in C3 plants[J]. Plant Cell Physiol，1987，28：635-641.

[11] 王 強，盧從明，張其德，等.超高產雜交稻兩優培九的光合作用、光抑制和C4途徑酶特性[J].中國科學（C輯），2002，45（5）：468-476.

[12] 陳根云，葉濟宇.草酰乙酸和蘋果酸對菠菜葉片和完整葉綠體光合作用的影響[J].植物生理學報，2001，27（6）：478-482.

[13] AUSTIN R B， FORD M A， MORGAN C L， et al. Genetic constraints on photosynthesis and yield in wheat[A]. SYBESMA C. Advanced in Photosynthesis Research（Vol 4）[C]. The Hague， the Netherlands： Martinus Nijhoff/Dr W Junk Publishers，1984.103-110.

[14] KU M S B， KANO-MURAKAMI Y， MATSUOKA M. Evolution and expression of C4 photosynthesis genes[J]. Plant Physiol，1996，111：949-957.

[15] EDWARDS G. Tuning up crop photosynthesis[J]. Nature Biotechnology，1999，17（1）：22-23.

[16] 焦德茂，李 霞，黃雪清，等.轉PEPC基因水稻的光合CO2同化和葉綠素熒光特性[J].科學通報，2001，46（5）：414-418.

[17] 周寶元，丁在松，趙 明.PEPC過表達可以減輕干旱脅迫對水稻光合的抑制作用[J]. 作物學報，2011，37（1）：112-118.

[18] 丁在松，周寶元，孫雪芳，等.干旱脅迫下PEPC過表達增強水稻的耐強光能力[J].作物學報，2012，38（2）：285-292.

（責任編輯 鄭 威）

3 討論

長期以來人們對C3植物中是否存在C4光合途徑一直持懷疑態度，因為C4植物葉片具有特殊的Kranz結構，而C3植物中沒有這樣的結構。但早有報道在C3作物大豆[9]、小麥[10]、水稻[11]葉片中有C4光合酶系統。將C4循環酶基因導入C3作物被認為是提高作物光合效率和發揮產量潛力的重要途徑。陳根云等[12]的研究發現，向C3植物菠菜中外加C4光合原初產物草酰乙酸或蘋果酸可提高葉片的光合能力，為在C3植物中建立C4微循環系統來提高光合效率的可能性提供了依據。

常規育種→生理育種→生物技術育種是作物育種的發展趨勢[13]，其中高光效生理育種是當代植物生理和育種工作者共同關注的問題，特別是C3植物中增加C4光合能力的研究引人注目[14，15]。為探明水稻中C4微循環及其生理功能，將玉米的高光效基因PEPC導入到新稻18中，獲得了一系列株高增加、根系發達、葉片變寬、莖稈增粗的轉基因株系。與對照相比，這些轉基因株系的生物學產量和經濟產量均增加，并且其光合酶活性也大大增強，這與焦德茂等[16]的研究結果一致。周寶元等[17]研究發現PEPC過表達可以減輕干旱脅迫對水稻光合作用的抑制；丁在松等[18]研究發現干旱脅迫下PEPC過表達增強水稻的耐強光能力，這和本研究轉基因植株的根系發達、莖稈增粗的形態變化相一致。轉基因株系的外形變化可能是轉PEPC基因水稻抗逆增產的生理基礎。因此，在現有良好株型和雜種優勢利用的基礎上，通過遺傳操作將C4光合酶基因導入我國高產水稻品種中，將開拓一條新的水稻育種途徑。

參考文獻：

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[12] 陳根云，葉濟宇.草酰乙酸和蘋果酸對菠菜葉片和完整葉綠體光合作用的影響[J].植物生理學報，2001，27（6）：478-482.

[13] AUSTIN R B， FORD M A， MORGAN C L， et al. Genetic constraints on photosynthesis and yield in wheat[A]. SYBESMA C. Advanced in Photosynthesis Research（Vol 4）[C]. The Hague， the Netherlands： Martinus Nijhoff/Dr W Junk Publishers，1984.103-110.

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[17] 周寶元，丁在松，趙 明.PEPC過表達可以減輕干旱脅迫對水稻光合的抑制作用[J]. 作物學報，2011，37（1）：112-118.

[18] 丁在松，周寶元，孫雪芳，等.干旱脅迫下PEPC過表達增強水稻的耐強光能力[J].作物學報，2012，38（2）：285-292.

（責任編輯 鄭 威）

3 討論

長期以來人們對C3植物中是否存在C4光合途徑一直持懷疑態度，因為C4植物葉片具有特殊的Kranz結構，而C3植物中沒有這樣的結構。但早有報道在C3作物大豆[9]、小麥[10]、水稻[11]葉片中有C4光合酶系統。將C4循環酶基因導入C3作物被認為是提高作物光合效率和發揮產量潛力的重要途徑。陳根云等[12]的研究發現，向C3植物菠菜中外加C4光合原初產物草酰乙酸或蘋果酸可提高葉片的光合能力，為在C3植物中建立C4微循環系統來提高光合效率的可能性提供了依據。

常規育種→生理育種→生物技術育種是作物育種的發展趨勢[13]，其中高光效生理育種是當代植物生理和育種工作者共同關注的問題，特別是C3植物中增加C4光合能力的研究引人注目[14，15]。為探明水稻中C4微循環及其生理功能，將玉米的高光效基因PEPC導入到新稻18中，獲得了一系列株高增加、根系發達、葉片變寬、莖稈增粗的轉基因株系。與對照相比，這些轉基因株系的生物學產量和經濟產量均增加，并且其光合酶活性也大大增強，這與焦德茂等[16]的研究結果一致。周寶元等[17]研究發現PEPC過表達可以減輕干旱脅迫對水稻光合作用的抑制；丁在松等[18]研究發現干旱脅迫下PEPC過表達增強水稻的耐強光能力，這和本研究轉基因植株的根系發達、莖稈增粗的形態變化相一致。轉基因株系的外形變化可能是轉PEPC基因水稻抗逆增產的生理基礎。因此，在現有良好株型和雜種優勢利用的基礎上，通過遺傳操作將C4光合酶基因導入我國高產水稻品種中，將開拓一條新的水稻育種途徑。

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[5] GONZALEZ D H， IGLESIAS A A， ANDEO C S. On the regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase activity from maize leaves by L-malate： Effect of pH[J]. J Plant Physiol，1984， 116：425-434.

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[8] KUNG S D，CHOLLET R， MARSHO T V. Crystallization and assay procedures of tobacco ribulose 1，5-bisphosphate carboxlase-oxygenase[A]. PIETRO A S. Method in Enzymology[C]. New York： Academic Press Inc，1980.

[9] 李衛華，盧慶陶，郝乃斌，等. 大豆葉片C4循環途徑酶[J].植物學報，2001，43（8）：805-808.

[10] HATA S， MATSUOKA M. Immunological studies on pyruvate orthophosphate dikinase in C3 plants[J]. Plant Cell Physiol，1987，28：635-641.

[11] 王 強，盧從明，張其德，等.超高產雜交稻兩優培九的光合作用、光抑制和C4途徑酶特性[J].中國科學（C輯），2002，45（5）：468-476.

[12] 陳根云，葉濟宇.草酰乙酸和蘋果酸對菠菜葉片和完整葉綠體光合作用的影響[J].植物生理學報，2001，27（6）：478-482.

[13] AUSTIN R B， FORD M A， MORGAN C L， et al. Genetic constraints on photosynthesis and yield in wheat[A]. SYBESMA C. Advanced in Photosynthesis Research（Vol 4）[C]. The Hague， the Netherlands： Martinus Nijhoff/Dr W Junk Publishers，1984.103-110.

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[17] 周寶元，丁在松，趙 明.PEPC過表達可以減輕干旱脅迫對水稻光合的抑制作用[J]. 作物學報，2011，37（1）：112-118.

[18] 丁在松，周寶元，孫雪芳，等.干旱脅迫下PEPC過表達增強水稻的耐強光能力[J].作物學報，2012，38（2）：285-292.

（責任編輯 鄭 威）