人血清對生殖支原體LAMPs誘導THP-1細胞表達TNF-α的影響

何 軍 ,游曉星 ,伍紹堅 ,田 巍 ,吳移謀

(1.南華大學附屬南華醫(yī)院檢驗科,湖南衡陽42100;2.南華大學病原生物學研究所)

支原體是一類缺乏細胞壁、呈高度多形性、能通過濾菌器、可在無細胞的培養(yǎng)中繁殖的最小原核細胞型微生物。生殖支原體(Mycoplasma genitalium,Mg)是從非淋菌性尿道炎患者尿道分泌物中分離出的一種支原體,可引起急慢性尿道炎、陰道炎、子宮內膜炎、盆腔炎、輸卵管性不孕等多種疾病,并且作為AIDS相關支原體與HIV患者的死亡密切相關[1-3]。由于支原體缺乏細胞壁,其膜表面存在的大量脂質相關膜蛋白(lipid-associated membrane proteins,LAMPs)是其黏附、定植、入侵宿主細胞以及引起宿主炎癥反應的物質基礎[4]。單核細胞是人類天然免疫的首要防線,也是分化為巨噬細胞、樹突狀細胞的共同前體細胞。本研究通過提取Mg LAMPs刺激THP-1細胞,初步探討LAMPs的活性成分及人血清對其誘導TNF-α水平變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Mg-37標準株由南華大學病原生物學研究所保存,人單核細胞系THP-1細胞購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。青霉素、多粘菌素B、LPS購自Solarbio;無支原體牛血清和超級新生胎牛血清購自四季青生物工程公司;RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone;PPLO購自BD公司;脂蛋白脂肪酶和蛋白酶K購自Sigma-Aldrich;人腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒購自eBioscience;1%人血清來自正常體檢者并經(jīng)其同意使用。

1.2 Mg培養(yǎng)及LAMPs的提取

將Mg菌液按1∶40比例接種于PPLO改良培養(yǎng)基中于95%CO2、37℃恒溫下培養(yǎng)3～4天,培養(yǎng)基顏色由玫瑰紅色變?yōu)榍辶恋某壬珪r,表示Mg生長已進入對數(shù)期。Mg LAMPs的提取按照參考文獻進行[5],BCA法測定蛋白濃度后置于-80℃?zhèn)溆谩g LAMPs在刺激前用100 μg/mL多粘菌素B處理2 h,去除可能存在的內毒素污染。

1.3 THP-1細胞培養(yǎng)及LAMPs刺激

THP-1細胞在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種前換無血清培養(yǎng)基,在24孔培養(yǎng)板中每孔接種1×105THP-1細胞,分別加入不同濃度的 LAMPs,LPS(100 ng/mL),PBS至孔中混勻孵育8 h。

1.4 TNF-α水平的測定及LAMPs的預處理

THP-1細胞被刺激后,經(jīng)兩次反復凍融后離心取上清,采用ELISA法根據(jù)具體操作說明書進行測定。LAMPs分別與100 μg/mL脂蛋白脂肪酶,蛋白酶K,人血清在37°C下混勻孵育2 h后再用于細胞刺激。

1.5 統(tǒng)計學分析

計量資料采用均數(shù)±標準差表示,每組實驗重復三次,組間比較采用t檢驗,運用SPSS 13.0軟件進行分析,P＜0.05表示其差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Mg LAMPs的提取及初步鑒定

Mg LAMPs提取后經(jīng)15%SDS-PAGE電泳,結果證實Mg LAMPs為一混合蛋白,大部分蛋白位于19～48 KDa之間(圖1)。

圖1 Mg LAMPs的SDS-PAGE蛋白質電泳圖 1:Mg LAMPs;2:蛋白Maker

2.2 LAMPs誘導THP-1細胞分泌TNF-α

以0.1～4.0 μg/mL的 Mg LAMPs分別誘導THP-1細胞8 h,ELISA結果顯示,TNF-α水平明顯增加,并且隨 LAMPs的濃度增加而增加。4.0 μg/mL LAMPs刺激后 TNF-α 水平增高了7倍(圖2)。

圖2 Mg LAMPs誘導THP-1細胞分泌TNF-α 與前一組相比,*:P＜0.05

2.3 Mg LAMPs中脂質成分誘導THP-1細胞分泌TNF-α

Mg LAMPs分別被100 μg/mL脂蛋白脂肪酶和蛋白酶K孵育2 h后刺激THP-1細胞,ELISA結果顯示,被脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase)處理的LAMPs誘導TNF-α水平明顯降低,而被蛋白酶 K(Proteinase K)處理的LAMPs誘導TNF-α水平變化不明顯(圖3)。

2.4 人血清上調LAMPs誘導的TNF-α水平

在與1%人血清(1%Serum)孵育2 h后,Mg LAMPs刺激THP-1細胞8 h,ELISA結果顯示TNF-α水平明顯上升,明顯高于同濃度未加人血清組(NOSerum),并且隨LAMPs濃度增加而增加(P＜0.05)(圖4)。

圖3 LAMPs中脂質成分誘導THP-1細胞分泌TNF-α 與PBS組相比,*:P＜0.05.Unstimulated:未刺激組;LPS:脂多糖

圖4 人血清上調LAMPs誘導的TNF-α水平 與1%人血清前一組比較,*:P＜0.05

3 討 論

支原體細胞膜是與宿主細胞相互作用的主要成分,而膜上豐富的類似于LPS的LAMPs是影響機體炎癥反應的主要蛋白。目前已證實LAMPs能誘導多種細胞分泌一系列炎癥因子和誘導細胞凋亡、壞死[6]。由于生物活性的發(fā)揮可能要通過LAMPs中各種蛋白相互作用,因些對LAMPs的整體研究相對單個脂蛋白來說更有意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Mg LAMPs能激活 NF-κB,并且與 TLR2 有關[7]。 NF-κB信號通路活化的重要作用是通過誘導激活下游的免疫及炎性相關因子的轉錄表達。本研究發(fā)現(xiàn)Mg LAMPs為混合蛋白,大部分蛋白位于19～48 KDa之間,具有明顯的生物活性,能激活THP-1細胞表達大量TNF-α,并且其水平與LAMPs濃度呈明顯的劑量依賴性。支原體感染多傾向于慢性或隱性感染,由于產生的TNF-α具有組織損傷和免疫保護雙重作用,最后走向取決于機體免疫系統(tǒng)之間的相互作用。

人血清中含有多種生物活性蛋白,其中包括介導LPS生物活性的脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein,LBP),CD14等。LBP由肝細胞合成和分泌,在血清中的正常濃度為5～10 mg/L,急性反應期可升高到200 mg/L,與LPS中的類脂體A具有高度親和性[8]。在血清中的CD14主要為可溶性CD14(soluble CD14,sCD14),主要由單核細胞產生,其正常濃度為2～5mg/ml,占血中全部CD14含量的99%[9]。TNF-α作為致機體產生炎癥反應的重要因子。sCD14能直接與LPS結合,介導LPS所致的TNF-α的產生。LBP本身并不能誘導TNF-α的產生,但LBP卻能明顯增強LPS對TNF-α的誘生作用,增加TNF-α mRNA轉錄的速度和程度,使TNF-α水平明顯上升[10]。我們推測人血清可能對類似于LPS的LAMPs有一定的作用,結果發(fā)現(xiàn),人血清能明顯上調LAMPs誘導的TNF-α的產生。研究發(fā)現(xiàn),脂質能夠與許多微生物中脂蛋白N-末端半胱氨酸的Src同源序列結合,而支原體的生物學活性也剛好位于N-末端脂肽部分[11]。通過脂蛋白脂肪酶和蛋白酶K預處理后發(fā)現(xiàn),LAMPs中誘導活性成分為脂質部分,并非蛋白部分。研究證實LAMPs的生物活性不僅與其脂質成分,脂肽的、脂肪酸鏈的飽和程度、數(shù)量及酰化程度有關[12-13],而且最近研究發(fā)現(xiàn),LBP能結合三酰化和二酰化脂肽,CD14能結合二酰化脂肽介導免疫反應[14-15]。本文作者推測人血清的上調作用可能是上清中LBP和sCD14的共同作用。因此,通過誘導TNF-α表達而對機體組織產生保護或損傷作用,這可能是Mg感染所引起的炎癥反應的基礎,同時也為Mg的致病機制研究及防治提供新的思路。

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