可食性動物組織中卡巴氧殘留標示物ELISA檢測方法的建立

張澤英+袁宗輝

摘要：將卡巴氧殘留標示物喹喔啉-2-羧酸（QCA）與γ-氨基丁酸（ABA）衍生成喹喔啉-2-甲酰胺丁酸（QCA-ABA），再與牛血清白蛋白（BSA）偶聯作為免疫原（QCA-ABA-BSA），將QCA與卵清白蛋白（OVA） 偶聯作為包被原（QCA-OVA），建立了豬可食性組織中QCA的間接競爭ELISA檢測方法。結果表明，最優的QCA-OVA包被抗原濃度為4 μg/mL，抗體稀釋倍數為1∶3.2×104，最適檢測范圍為0.2～51.2 ng/mL，最低檢測限為0.6 μg/kg，對豬肌肉和豬肝臟的添加回收率為47.4%～87.7%。

關鍵詞：卡巴氧；喹喔啉-2-羧酸；ELISA；殘留檢測

中圖分類號：TS251.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0193-04

Development of an ELISA Method for Screening of Marker Residue of Carbadox in Animal Edible Tissues

ZHANG Ze-ying1，YUAN Zong-hui2

（1.Department of Food Engineering， Wuhan Bioengineering Institute， Wuhan 430015， China；

2.Ministry of Agriculture Key Laboratory of Food Safety Evaluation， Wuhan 430070， China）

Abstract： Derivatized quinoxaline-2-carboxylic acids a marker residue of carbadox with γ-amino butyric acid（ABA）， was conjugated to BSA to prepare immunogen（QCA-ABA-BSA）， and QCA was conjugated to OVA to prepare coating antigen（QCA-OVA）. Indirect competitive ELISA for QCA derivatizative （QCA-ABA） was established to determine QCA in pig edible tissues. The results of the experiment demonstrated that the optimal concentration of the coating antigen， dilution multiple of polyclonal antibody against QCA-ABA were 4 μg/mL， 1∶3.2×104， respectively. The standard curve of indirect competitive ELISA is also established. The curve has a favorable linearity relation within the concentration range of 0.2～51.2 ng/mL， indicaing that the lowest detection limit is 0.6 μg/kg， with the recovery rate of 47.4%～87.7% in swine muscle and liver tissues.

Key words： carbadox； QCA； ELISA； residue determination

收稿日期：2013-09-29

基金項目：上海市科技興農計劃項目（滬農科攻字2003B99）

作者簡介：張澤英（1980-），女，四川瀘州人，講師，碩士，主要從事食品分析檢測工作，（電話）027-89665836（電子信箱）27185096@qq.com；

通訊作者，袁宗輝，教授，博士生導師，（電子信箱）zonghui55@163.com。

卡巴氧于1999年被歐盟列為禁用藥，隨后許多國家也出臺了相應的法規限制該藥的使用。然而，由卡巴氧殘留引發的食品安全問題仍時有發生。目前，大量出口到歐盟等國的可食性動物組織主要是利用色譜方法，如LC-UV[1，2]、GC-MS[3]和LC-MS-MS[4-7]監測卡巴氧及其代謝物的殘留，這些技術耗時、耗力，并且需要大量資金，不適合高通量篩選，因此很有必要開發一種快速、低廉的高通量篩選方法來滿足卡巴氧殘留監測的需求。ELISA以免疫結合反應為原理，在簡化分析過程、提高速度和降低成本方面具有特殊意義，能彌補上述不足，因而發展迅速。該研究以卡巴氧殘留標示物喹喔啉-2-羧酸（Quinoxaline-2-carboxylic acid，QCA）為半抗原制備多抗，旨在建立一種可用于可食性動物組織中卡巴氧殘留的ELISA 檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

喹喔啉-2-羧酸（QCA，≥99%，Sigma公司）；牛血清白蛋白（BSA，≥98%，Sigma公司）；卵清白蛋白（OVA，>90%，Sigma公司）；羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶（Sigma公司）；其他試劑均為分析純。

96 孔聚苯乙烯酶聯反應板（浙江黃巖化學塑料實驗廠）；Oasis MAX固相萃取柱（60 mg/3 mL，上海楚柏實驗室設備有限公司）；BIORAD Model 550 型酶聯免疫檢測儀（日本BIORAD公司）；UV751GD 型紫外可見光分光光度計（上海第三分析儀器廠）；R200D型電子分析天平（賽多利斯公司（德國）；HKCB23 型恒溫磁力攪拌器（溫州市醫療電器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 人工抗原和包被原的合成 人工抗原和包被原的合成參照文獻[8]。

1.2.2 免疫程序及抗體的制備 免疫程序及抗體的制備參照文獻[8]。

1.2.3 間接競爭ELISA 基本程序 間接競爭ELISA 基本程序參照文獻[9]。①以一定濃度的包被原復合物包被96（8×12）孔酶標板，每孔100 μL，4 ℃包被過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌2次，每次靜置2 min，于干凈吸水紙上拍干；②以1% BSA溶液封閉，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，拍干；③每列A-G孔加入系列稀釋的被檢測抗原（或磷酸鹽緩沖液）和一定稀釋度的抗體的預混液，H孔作為零對照，只加特定稀釋度的陰性血清，37 ℃孵育1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，拍干；④加入稀釋度為1∶5 000的羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶標記物，每孔100 μL，37 ℃反應1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌5次，拍干；⑤加入TMB顯色液，每孔100 μL，室溫避光顯色15～20 min；⑥終止顯色反應，每孔加入2 mol/L H2SO4 溶液50 μL，用酶標檢測儀測定各孔的OD490值；⑦依據OD490值，以待測孔OD值大于或等于陰性對照孔的3倍，即判斷為陽性。

1.2.4 間接競爭ELISA反應條件的優化 采用方陣滴定法和間接競爭ELISA法確定抗原最佳包被濃度、抗體最佳稀釋度、抗體最佳工作量和最佳競爭時間。

1.2.5 標準曲線的制備 在間接競爭ELISA反應的最佳反應條件下，將QCA用二氯甲烷稀釋成0.0、0.2、0.8、3.2、12.8、51.2 ng/mL系列濃度，加入一定量的衍生試劑和催化劑，37 ℃衍生反應，反應完畢后47 ℃下氮氣吹干，用磷酸緩沖液（pH 7.4）定容至原始濃度，用間接競爭ELISA測定。所獲得的標準品吸光值的平均值除以0.0 ng/mL標準的吸光值為抑制率（B/B0），以QCA溶液濃度的對數值（lg[QCA]）為橫坐標，以抑制率（B/B0）為縱坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程。

1.2.6 添加回收率的測定 取2 g組織（豬肉、豬肝）均質物，加入5%偏磷酸和10%甲醇溶液各5 mL，振蕩2 min，4 800 r/min離心10 min，取上清液，再按上述步驟重復提取1次，合并兩次提取液；在提取液中加入6 mL乙酸乙酯，振蕩2 min，4 800 r/min離心10 min，取上清液，重復萃取1次，合并乙酸乙酯層；加入0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）5 mL反萃取，振蕩1 min，提取下清液，再按上述步驟重復提取1次，合并水相。分別用3 mL甲醇和3 mL水活化Oasis MAX固相萃取柱。取3 mL樣品提取液注入活化后的Oasis MAX固相萃取柱，待樣品提取液全部流出后，分別用0.05 mol/L NaOH溶液3 mL、甲醇3 mL淋洗，除去雜質干擾，最后用2%甲酸甲醇溶液3 mL洗脫，收集洗脫液，45 ℃下氮氣吹干，加入2 mL二氯甲烷溶解殘渣。加入一定量的衍生試劑和催化劑37 ℃衍生反應5 h，反應完畢后47 ℃下氮氣吹干，向離心管中加入樣本稀釋液2 mL，振蕩30 s，作為試樣溶液，供ELISA方法測定。

2 結果與分析

2.1 優化的ELISA反應條件

2.1.1 抗原最佳包被濃度 以方陣滴定法中OD值在1.0左右的包被抗原濃度（4 μg/mL）為中心濃度，等差設5個濃度（2、3、4、5、6 μg/mL）作間接競爭ELISA，曲線斜率最大的抗原濃度為最佳包被濃度（圖1）。結果表明，最佳抗原包被濃度為4 μg/mL。

2.1.2 抗體最佳稀釋度 方陣滴定確定的抗體稀釋度（1∶3.2×104）為中心濃度，設計1∶1.6×104、1∶2.4×104、1∶3.2×104、1∶4.8×104、1∶6.4×104 5個濃度作間接競爭ELISA（圖2）。結果表明，抗體稀釋度為1∶3.2×104時，曲線斜率最大，抗體反應最靈敏。

2.1.3 樣品與抗體最佳比例 設計5個抗體與藥物的工作配比（70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70），作間接競爭ELISA，曲線斜率較大，對ELISA影響較小的抗體工作量為最佳工作量（圖3）。結果表明，不同的配比對標準曲線斜率的影響較小，為了減少殘留檢測中組織對ELISA反應的影響，應盡量較少樣品反應量，因此選擇樣品與抗體的配比為30∶70。

2.1.4 抗原抗體最適競爭反應時間 選擇溫度37 ℃，分別以30、60、90、120 min 4個時間段進行競爭反應，測其OD490值選擇最佳反應時間和溫度（圖4）。結果表明，最佳反應時間為60 min。

2.2 標準曲線

以標準品吸光值的平均值除以0 ng/mL標準的吸光值為抑制率（B/B0），以抑制率（B/B0）為縱坐標，以QCA溶液濃度的對數值（lg[QCA]）為橫坐標，繪制標準曲線（圖5）。從圖5可知，在0.2～51.2 ng/mL之間，曲線呈良好的線形關系而且斜率也較大。擬和的線性回歸直線方程為y=-0.240 3x+0.665 4，R2=0.991 1，符合線性關系的判斷標準，其中y為B/B0，x為lg[QCA]。依據標準曲線，可得到相應的lg[QCA]，從而可知其殘留量。

2.3 回收率

豬肌肉和豬肝臟樣本添加QCA濃度為1、5、20 μg/kg，按照前述方法處理后進行間接競爭性ELISA，其回收率和變異系數測定結果見表1。

表1結果表明，豬肉、豬肝組織中添加回收率為47.4%～87.7%，批間變異系數均<30%，符合我國卡巴氧殘留酶聯免疫檢測要求。

3 小結與討論

目前國內外廣泛使用的測定卡巴氧及其標示物殘留量的方法均是色譜法，這些方法不僅需要昂貴的儀器，而且對技術要求較高，不適合在基層推廣應用。免疫檢測技術具有簡便、快速、靈敏的特點，因此近十多年來在食品中獸藥殘留檢測方面取得了迅速的發展。

本研究首次報道了卡巴氧殘留標示物QCA殘留的酶聯免疫檢測方法，由于QCA分子量較小，分子結構簡單，未能獲得直接捕獲QCA的抗體，只得到針對其衍生物QCA-ABA的特異性抗體。Kevin[10]和Chang等[11]采用衍生動物組織中3-氨基-2惡唑烷酮（AOZ），以檢測其衍生物達到檢測AOZ殘留物的ELISA檢測技術。該研究將動物組織中的QCA經提取、凈化、衍生成QCA-ABA，用所建立的ELISA方法可檢測動物組織中的QCA殘留量。從建立的工作曲線來看，具有靈敏度高，特異性強，精確度高及能進行大批量測定等優點。該研究所建立的檢測方法為卡巴氧殘留標示物檢測試劑盒的生產提供基礎。

目前采用酶聯免疫檢測法測定藥物殘留的包括氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、鹽酸克倫特羅、鏈霉素等幾種藥物。不同于氯霉素和磺胺二甲基嘧啶等結構較復雜的藥物，QCA的化學結構中只有1個活性基團能用于同載體蛋白相偶聯，在包被原和免疫原的載體蛋白都連接在這個基團時，檢測方法的靈敏度受到一定影響。筆者試圖制備直接針對QCA的特異性抗體，但未能成功。為了簡化卡巴氧殘留ELISA檢測中組織處理過程，制備直接捕獲QCA小分子的特異性抗體更為必要，而這方面的工作有待進一步的研究。

參考文獻：

[1] RUTALJ M， BAZULIC D， SAPUNAR-POSTRUZNIK J， et al. Quinoxaline-2-carboxylic acid （QCA） in swine liver and muscle[J]. Food Addit Contam，1996，13（8）：879-882.

[2] WU Y， YU H， WANG Y， et al. Development of a high-performance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of quinoxaline-2-carboxylic acid and methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid in animal tissues[J]. J Chromatography A，2007，146（1）：1-7.

[3] DELLA W， LUCY P， MARTIN M， et al. Determination of quinoxaline-2-carboxylic acid， the major metabolite of carbadox in porcine liver by isotope dilution gas chromatography electron capture negative ionization mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta，2004，508（2）：147-158.

[4] BOISON J， LEE S， GEDIR R. A determinative and confirmatory method for residues of the metabolites of carbadox and olaquindox in porcine tissues[J]. Analytica Chimica Acta，2009， 637（1）：128-134.

[5] MEROU A， KAKLAMANOS G， THEODORIDIS G. Determination of carbadox and metabolites of carbadox and olaquindox in muscle tissue using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Chromatography B， 2012，881-882： 90-95.

[6] HUTCHINSON M， YOUNG P， KENNEDY D. Confirmation of carbadox and olaquindox metabolites in porcine liver using liquid chromatography-electrospray， tandem mass spectrometry[J]. J Chromatography B，2005，816（1-2）：15-20.

[7] HORIE M， MURAYAMA M. Determination of carbadox metabolites， quinoxaline-2-carboxylic acid and desoxycarbadox， in swine muscle and liver by liquid chromatography mass spectrometry[J]. Shokuhin Eiseigaku Zasshi，2004，45（3）： 135-140.

[8] 張澤英，袁宗輝.喹喔啉-2-羧酸人工抗原合成與抗體制備[J].武漢生物工程學院學報，2012，8（1）：18-22.

[9] PORSTMANN T， KIESSIG S. Enzyme immunoassay techniques an overview[J]. Immunological Methods，1992，150（1-2）：5-21.

[10] KEVIN M， ANTHONY C， CHRISTOPHER T， et al. Production and characterization of polyclonal antibodies to a derivative of 3-amino-2-oxazolidinone， a metabolite of the nitrofuran furazolidone[J]. Analytica Chimica Acta，2004，520（1-2）： 79-86.

[11] CHANG C， PENG D P， WU J E， et al. Development of an indirect competitive ELISA for the detection of furazolidone marker residue in animal edible tissues[J]. J Agric Food Chem，2008，56（5）：1525-1531.

（責任編輯 胡西洲）

本研究首次報道了卡巴氧殘留標示物QCA殘留的酶聯免疫檢測方法，由于QCA分子量較小，分子結構簡單，未能獲得直接捕獲QCA的抗體，只得到針對其衍生物QCA-ABA的特異性抗體。Kevin[10]和Chang等[11]采用衍生動物組織中3-氨基-2惡唑烷酮（AOZ），以檢測其衍生物達到檢測AOZ殘留物的ELISA檢測技術。該研究將動物組織中的QCA經提取、凈化、衍生成QCA-ABA，用所建立的ELISA方法可檢測動物組織中的QCA殘留量。從建立的工作曲線來看，具有靈敏度高，特異性強，精確度高及能進行大批量測定等優點。該研究所建立的檢測方法為卡巴氧殘留標示物檢測試劑盒的生產提供基礎。

目前采用酶聯免疫檢測法測定藥物殘留的包括氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、鹽酸克倫特羅、鏈霉素等幾種藥物。不同于氯霉素和磺胺二甲基嘧啶等結構較復雜的藥物，QCA的化學結構中只有1個活性基團能用于同載體蛋白相偶聯，在包被原和免疫原的載體蛋白都連接在這個基團時，檢測方法的靈敏度受到一定影響。筆者試圖制備直接針對QCA的特異性抗體，但未能成功。為了簡化卡巴氧殘留ELISA檢測中組織處理過程，制備直接捕獲QCA小分子的特異性抗體更為必要，而這方面的工作有待進一步的研究。

參考文獻：

[1] RUTALJ M， BAZULIC D， SAPUNAR-POSTRUZNIK J， et al. Quinoxaline-2-carboxylic acid （QCA） in swine liver and muscle[J]. Food Addit Contam，1996，13（8）：879-882.

[2] WU Y， YU H， WANG Y， et al. Development of a high-performance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of quinoxaline-2-carboxylic acid and methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid in animal tissues[J]. J Chromatography A，2007，146（1）：1-7.

[3] DELLA W， LUCY P， MARTIN M， et al. Determination of quinoxaline-2-carboxylic acid， the major metabolite of carbadox in porcine liver by isotope dilution gas chromatography electron capture negative ionization mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta，2004，508（2）：147-158.

[4] BOISON J， LEE S， GEDIR R. A determinative and confirmatory method for residues of the metabolites of carbadox and olaquindox in porcine tissues[J]. Analytica Chimica Acta，2009， 637（1）：128-134.

[5] MEROU A， KAKLAMANOS G， THEODORIDIS G. Determination of carbadox and metabolites of carbadox and olaquindox in muscle tissue using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Chromatography B， 2012，881-882： 90-95.

[6] HUTCHINSON M， YOUNG P， KENNEDY D. Confirmation of carbadox and olaquindox metabolites in porcine liver using liquid chromatography-electrospray， tandem mass spectrometry[J]. J Chromatography B，2005，816（1-2）：15-20.

[7] HORIE M， MURAYAMA M. Determination of carbadox metabolites， quinoxaline-2-carboxylic acid and desoxycarbadox， in swine muscle and liver by liquid chromatography mass spectrometry[J]. Shokuhin Eiseigaku Zasshi，2004，45（3）： 135-140.

[8] 張澤英，袁宗輝.喹喔啉-2-羧酸人工抗原合成與抗體制備[J].武漢生物工程學院學報，2012，8（1）：18-22.

[9] PORSTMANN T， KIESSIG S. Enzyme immunoassay techniques an overview[J]. Immunological Methods，1992，150（1-2）：5-21.

[10] KEVIN M， ANTHONY C， CHRISTOPHER T， et al. Production and characterization of polyclonal antibodies to a derivative of 3-amino-2-oxazolidinone， a metabolite of the nitrofuran furazolidone[J]. Analytica Chimica Acta，2004，520（1-2）： 79-86.

[11] CHANG C， PENG D P， WU J E， et al. Development of an indirect competitive ELISA for the detection of furazolidone marker residue in animal edible tissues[J]. J Agric Food Chem，2008，56（5）：1525-1531.

（責任編輯 胡西洲）

本研究首次報道了卡巴氧殘留標示物QCA殘留的酶聯免疫檢測方法，由于QCA分子量較小，分子結構簡單，未能獲得直接捕獲QCA的抗體，只得到針對其衍生物QCA-ABA的特異性抗體。Kevin[10]和Chang等[11]采用衍生動物組織中3-氨基-2惡唑烷酮（AOZ），以檢測其衍生物達到檢測AOZ殘留物的ELISA檢測技術。該研究將動物組織中的QCA經提取、凈化、衍生成QCA-ABA，用所建立的ELISA方法可檢測動物組織中的QCA殘留量。從建立的工作曲線來看，具有靈敏度高，特異性強，精確度高及能進行大批量測定等優點。該研究所建立的檢測方法為卡巴氧殘留標示物檢測試劑盒的生產提供基礎。

目前采用酶聯免疫檢測法測定藥物殘留的包括氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、鹽酸克倫特羅、鏈霉素等幾種藥物。不同于氯霉素和磺胺二甲基嘧啶等結構較復雜的藥物，QCA的化學結構中只有1個活性基團能用于同載體蛋白相偶聯，在包被原和免疫原的載體蛋白都連接在這個基團時，檢測方法的靈敏度受到一定影響。筆者試圖制備直接針對QCA的特異性抗體，但未能成功。為了簡化卡巴氧殘留ELISA檢測中組織處理過程，制備直接捕獲QCA小分子的特異性抗體更為必要，而這方面的工作有待進一步的研究。

參考文獻：

[1] RUTALJ M， BAZULIC D， SAPUNAR-POSTRUZNIK J， et al. Quinoxaline-2-carboxylic acid （QCA） in swine liver and muscle[J]. Food Addit Contam，1996，13（8）：879-882.

[2] WU Y， YU H， WANG Y， et al. Development of a high-performance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of quinoxaline-2-carboxylic acid and methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid in animal tissues[J]. J Chromatography A，2007，146（1）：1-7.

[3] DELLA W， LUCY P， MARTIN M， et al. Determination of quinoxaline-2-carboxylic acid， the major metabolite of carbadox in porcine liver by isotope dilution gas chromatography electron capture negative ionization mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta，2004，508（2）：147-158.

[4] BOISON J， LEE S， GEDIR R. A determinative and confirmatory method for residues of the metabolites of carbadox and olaquindox in porcine tissues[J]. Analytica Chimica Acta，2009， 637（1）：128-134.

[5] MEROU A， KAKLAMANOS G， THEODORIDIS G. Determination of carbadox and metabolites of carbadox and olaquindox in muscle tissue using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Chromatography B， 2012，881-882： 90-95.

[6] HUTCHINSON M， YOUNG P， KENNEDY D. Confirmation of carbadox and olaquindox metabolites in porcine liver using liquid chromatography-electrospray， tandem mass spectrometry[J]. J Chromatography B，2005，816（1-2）：15-20.

[7] HORIE M， MURAYAMA M. Determination of carbadox metabolites， quinoxaline-2-carboxylic acid and desoxycarbadox， in swine muscle and liver by liquid chromatography mass spectrometry[J]. Shokuhin Eiseigaku Zasshi，2004，45（3）： 135-140.

[8] 張澤英，袁宗輝.喹喔啉-2-羧酸人工抗原合成與抗體制備[J].武漢生物工程學院學報，2012，8（1）：18-22.

[9] PORSTMANN T， KIESSIG S. Enzyme immunoassay techniques an overview[J]. Immunological Methods，1992，150（1-2）：5-21.

[10] KEVIN M， ANTHONY C， CHRISTOPHER T， et al. Production and characterization of polyclonal antibodies to a derivative of 3-amino-2-oxazolidinone， a metabolite of the nitrofuran furazolidone[J]. Analytica Chimica Acta，2004，520（1-2）： 79-86.

[11] CHANG C， PENG D P， WU J E， et al. Development of an indirect competitive ELISA for the detection of furazolidone marker residue in animal edible tissues[J]. J Agric Food Chem，2008，56（5）：1525-1531.

（責任編輯 胡西洲）