乳糖酸產生菌的發酵培養基優化

,,

(沈陽農業大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

乳糖酸(LactobionicAcid)是集修護、抗老、保濕、抗氧化、促進肌膚更新[1-2]于一身的新型多羥基有機酸[3]。乳糖酸本身即存在于人體中,因其具有良好的吸濕性、抗氧化性、金屬螯合性以及溫和的酸感,被廣泛應用于化妝品行業、食品制造業、醫藥業和精細化工行業中作為皮膚保養品[2]、食品添加劑、Wisconsin移植液[4]、增強紅霉素及克拉霉素等抗生素的溶解性[5]和生物降解成分等。

迄今為止,乳糖酸的生產方法主要有化學催化法[6-8]、酶法[9-11]和生物轉化法[12-13],但化學催化法伴有多種副產物產生,酶法的生產成本較高,都限制了乳糖酸的工業產量和市場占有率。每年約有290萬t廢棄乳糖排放到環境中,利用微生物將過剩乳糖轉化為乳糖酸,可以變廢為寶,增加附加值,并大大減少環境壓力,造福于民[14-15]。

本文應用Plackett-Burman實驗設計系統考察了影響土生拉烏爾菌RsoultellaterrigenaY20生產乳糖酸的培養基成分,發現該菌是耐高濃度乳糖的菌株且具有高產潛力,這對于進一步推動乳糖酸的產業化是有利的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土生拉烏爾菌Y20(RsoultellaterrigenaY20) 由沈陽農業大學微生物實驗室分離并保存;斜面培養基(%):乳糖1.0,NH4NO30.2,NaCl 0.05,K2HPO40.1,KH2PO40.1,MgSO40.05,瓊脂1.5,pH7.2～7.4;種子培養基(%):乳糖10.0,蛋白胨1.0,NaCl 0.05,K2HPO40.1,KH2PO40.1,MgSO40.05,pH 7.2～7.4。液體發酵培養基(%):乳糖12.0,蛋白胨1.0,NaCl 0.05,K2HPO40.1,KH2PO40.1,MgSO40.05,pH7.2～7.4。乳糖 沈陽市東興試劑廠;硝酸銨 沈陽化學試劑廠;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、NaOH 沈陽化學試劑廠;乳糖酸 Sigma公司;NaCl 沈陽沈一精細化學品有限公司;蛋白胨、酵母膏 北京奧博星生物技術責任有限公司;瓊脂 Sanland Chemical Co,LTD;乙腈、檸檬酸、磷酸氫二鈉 天津市大茂化學試劑廠。

AIR TECH超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;LZDX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;HG303-4A電熱恒溫培養箱 南京實驗儀器廠;DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;JD200-3型電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;Waters2487高效液相色譜儀 美國waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 種子培養:250mL三角瓶裝種子培養基50mL,115℃滅菌20min,接種搖瓶培養,搖床轉速180r/min,溫度30℃,培養12h。

搖瓶發酵:250mL三角瓶裝發酵培養基50mL,種子液以2%的接種量接入發酵培養基中,轉速180r/min,溫度30℃,培養48h。

1.2.2 乳糖酸含量的測定 用高效液相色譜法對乳糖酸生產菌株RsoultellaterrigenaY20的產乳糖酸能力進行定量測定,以NH2P-50為色譜柱,CH3CN和40mmol/L Na2HPO4-20mmol/L檸檬酸緩沖液為流動相,在pH5.0的條件下,以6∶4的比率,0.8mL/min的流速,在40℃下以低比率泵進,進樣量為10μL,用示差檢測器檢測。

1.2.3 單因素實驗設計

1.2.3.1 氮源種類對乳糖酸產量的影響 在溫度為28℃,乳糖含量為120g/L,Mg2+濃度為0.5g/L,Na+濃度為0.5g/L,pH7.2的條件下,分別以硝酸銨、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏和尿素為氮源,含量均為10g/L,恒溫培養2d,以氮源種類為橫坐標,乳糖酸產量為縱坐標,重復3次,確定Y20的最佳氮源種類。

1.2.3.2 氮源含量對乳糖酸產量的影響 在溫度為28℃,乳糖含量為120g/L,Mg2+濃度為0.5g/L,pH為7.2的條件下,蛋白胨含量分別為5、10、15、20、25g/L,硝酸銨含量分別為1、2、3、4、5g/L時,恒溫培養2d,以氮源含量為橫坐標,乳糖酸產量為縱坐標,重復3次,確定Y20的最適氮源含量。

1.2.3.3 碳源含量對乳糖酸產量的影響 其他條件不變,碳源(即乳糖)含量分別為20、40、60、80、100、120、140g/L時,恒溫培養2d,以碳源含量為橫坐標,乳糖酸產量為縱坐標,重復3次,確定Y20的最適碳源含量。

1.2.3.4 pH對乳糖酸產量的影響 其他條件不變,pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0時,考察其對乳糖酸產量的影響。

1.2.3.5 無機鹽離子對乳糖酸產量的影響 其他條件不變,Mg2+濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/L,Na+濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/L時,考察無機鹽離子對乳糖酸產量的影響。

1.2.4 響應面實驗設計

1.2.4.1 Plackett-Burman設計 在單因素實驗的基礎上,選用N=8的Plackett-Burman設計對發酵培養基中的8個組分的重要性進行考察,每個因素取高低兩個水平,高水平約為低水平的1.25倍,每個實驗組設置3個平行,以乳糖酸產量的平均值為響應值Y,實驗因素水平見表1。用Design Expert8.0.5軟件對實驗數據進行處理,比較各因素的t值和可信度。

表1 Plackett-Burman實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.4.2 最陡爬坡實驗 對Plackett-Burman 實驗的因素作顯著性分析,找出主要因素。根據擬合函數回歸系數的符號和大小來設計主要因素的最陡上升路徑,正效應的因素取較高值,負效應的因素取較低值。實驗組數由經驗來定,步長由主要因素的效應值確定。通過使主要因素同時朝響應值增大的方向變化,找出峰值,從而逼近最大的響應區域,乳糖酸含量最高的處理,即為下一步響應面分析的中心點。

1.2.4.3 Box-Behnken實驗設計 選擇Plackett-Burman實驗中對RsoultellaterrigenaY20乳糖酸的產量有顯著性影響的三個因素作為Box-Behnken設計所要考察的變量并對其進行三水平(-1、0、+1)編碼,從而獲得乳糖酸產量的最佳培養基組成,實驗因素與水平設計見表2。

表2 Box-Behnken實驗的因素與水平設計Table 2 Factors and levels of Box-Behnken Design

1.2.4.4 模型驗證 用Design Expert8.0.5軟件對多元函數進行擬合和方差分析,并得到最佳培養基組合,再按照所得到的參數進行驗證實驗,以檢驗模型的重復性和可靠性。

2 結果與討論

2.1 乳糖酸含量的測定

配制乳糖酸標樣的濃度分別為25、50、75、100、125、150mg/mL的梯度溶液,用高效液相色譜法測定其峰面積,繪制乳糖酸標準曲線,乳糖酸標準曲線見圖1。

圖1 乳糖酸標準曲線 Fig.1 Lactobionic acid standard curve

乳糖酸的產量與峰面積符合線性相關方程y=3907.2x-2657.1,x代表乳糖酸濃度,y代表峰面積,相關系數R2=0.9993,說明該方程具有很好的相關性,可用于乳糖酸含量的測定。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 氮源種類對乳糖酸產量的影響 由圖2可知,在上述供試的6種氮源中,硝酸銨和蛋白胨對乳糖酸的產量影響較大且影響效果差不多,這是因為該菌利用氮源的能力非常強,既可以利用無機氮源也可以利用有機氮源,無機氮源有硫酸銨、硝酸銨和尿素,其中硝酸銨的含氮量為35%,大于硫酸銨的含氮量,所以乳糖酸的產量也相對較高。雖然尿素的含氮量為46.7%,但是該菌能以尿素為氮源,是由于該菌體內含有脲酶,脲酶的最適溫度為60℃左右,而乳糖氧化酶的最適溫度在30℃左右,而脲酶的活性受溫度影響較大,因此利用尿素為氮源產乳糖酸的含量就會大幅下降。有機氮源中蛋白胨的含氮量≥12%,牛肉膏的含氮量≥7%,胰蛋白胨的含氮量≥10%,所以該菌利用蛋白胨產乳糖酸的能力較強,而且該菌利用有機氮源的能力要高于無機氮源,所以導致硝酸銨和蛋白胨的影響效果相似。考慮到有機氮源和無機氮源的搭配,故選硝酸銨和蛋白胨為復合氮源。

圖2 不同氮源對乳糖酸產量的影響 Fig.2 Different nitrogen sources on the influence of Lactobionic Acid production

2.2.2 氮源含量對乳糖酸產量的影響 選擇單一氮源蛋白胨和硝酸銨分別測定它們的乳糖酸產量。由圖3可知,起初乳糖酸產量隨著氮源含量的增加而增加,但到氮源含量達到一定值后,乳糖酸產量基本維持恒定。這是因為起初底物不足,乳糖酸的產量會隨著氮源含量的增加而增加,當增加到一定值時,由于該菌中乳糖氧化酶的含量是有一定限度的,不會隨之增加,所以乳糖酸的產量基本維持恒定。

2.2.3 碳源含量對RsoultellaterrigenaY20乳糖酸產量的影響 由圖4可知,隨著乳糖含量的增加,乳糖酸產量逐漸增大,當培養基中乳糖含量達到10%左右時,乳糖酸產量達到最大值,之后隨著乳糖含量的增多,反而有下降的趨勢,這可能是因為,當底物濃度不足時,乳糖酸的產量會隨著底物濃度的增高而增高,但是底物濃度過高會抑制菌體的生長,進而會減少乳糖酸的分泌和積累。

圖3 氮源含量對乳糖酸產量的影響 Fig.3 Nitrogen sources on the influence of Lactobionic Acid production

圖4 碳源含量對乳糖酸產量的影響 Fig.4 Carbon source content on the influence of Lactobionic Acid production

2.2.4 pH對RsoultellaterrigenaY20乳糖酸產量的影響 由圖5可知,土生拉烏爾菌RsoultellaterrigenaY20的最適pH為7.0左右,此時乳糖酸的產量最高達89.25g/L。pH過高或過低可能會影響菌體中乳糖氧化酶的活性,進而影響乳糖酸的產量。

圖5 pH對乳糖酸產量的影響 Fig.5 pH on the influence of Lactobionic Acid production

2.2.5 無機鹽離子濃度對乳糖酸產量的影響 由上圖可知,土生拉烏爾菌RsoultellaterrigenaY20的乳糖酸產量隨離子濃度的增大而增大,之后趨于穩定,這可能是因為Mg2+對乳糖氧化酶活性的高低有一定的影響,Na+主要影響菌體的形態和滲透壓,所以隨著離子濃度的增大,對乳糖酸的產量均有一定的促進作用,但這種促進作用不可能是無限的,當離子濃度達到一定值時,促進作用減弱。

圖6 無機鹽離子對乳糖酸產量的影響 Fig.6 Inorganic salt ion on the influence of Lactobionic Acid production

2.3 Plackett-Burman實驗

在單因素實驗的基礎上,按照N=12的8因素2水平Plackett-Burman設計進行實驗,每組3個平行,搖瓶發酵的結果取平均值,響應值為乳糖酸產量。Plackett-Burman設計及響應值見表3,各因素效應及顯著性分析見表4。

表3 Plackett-Burman設計與結果Table 3 Plackett-Burman design and results of

表4 Plackett-Burman各因素效應及顯著性分析Table 4 Plackett-Burman factors effect and significant analysis

由表3可看出,KH2PO4表現為負效應,其余均為正效應。可信度大于90%的因素為乳糖、硝酸銨、蛋白胨和初始pH,其中乳糖的可信度大于95%,表現為極顯著。

2.4 最陡爬坡實驗

Plackett-Burman實驗篩選出的三個最顯著因素全為正效應,其濃度水平應增加,根據三個因素的效應值大小設計它們的變化方向及步長進行最陡爬坡實驗[16],實驗設計結果見表5。

表5 最陡爬坡實驗結果Table 5 Results of steepest ascent test

從表5可看出,最優培養基條件在第3組實驗附近,因此以第3組的水平作為響應面實驗的中心點,即乳糖110g/L,蛋白胨17.5g/L,硝酸銨2.9g/L。

2.5 Box-Behnken實驗結果分析

根據PB實驗和最陡爬坡實驗結果確定Box-Behnken實驗的三個因素及水平,Box-Behnken實驗結果見表6,利用Design Export8.0.5軟件對Box-Behnken實驗的結果進行回歸擬合,得到響應值Y與因子X之間的回歸方程:Y=93.16+4.24A+5.82B+1.87C-1.30AB-0.34AC+1.16BC-9.38A2+1.32B2-1.19C2。

表6 Box-Behnken實驗設計與結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

根據表6的結果,運用Design Export8.0.5軟件對其進行方差分析和模型的顯著性分析,結果見表7。

表7 回歸方程的方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

從表7中可看出,模型p<0.0001,高度顯著,失擬項p=0.8293,失擬不顯著,相關系數R2=0.9935說明該模型與實際實驗擬合很好,調整后的R2=0.9851,即表明該模型可以解釋98.51%的發酵產乳糖酸水平的變化,進一步說明了回歸方程的擬合程度較好[17]。各因素的回歸系數及方差分析顯示,因素A、B、C表現為極顯著,二次項A2表現為極顯著,B2和C2表現為顯著,一次項中的AB和BC表現為顯著,影響大小的先后順序為B>A>C,說明實驗中的各個因素對響應值的影響并非簡單的線性關系,而是具有很好的交互性。

2.6 響應面優化結果的分析

由二次回歸方程所得到的響應面圖及相應的等高線圖見圖7～圖9。各因素交互作用對響應值乳糖酸產量的影響由圖可直觀地反映出來。

圖7 Y=f(A,B)的響應面分析圖及其等高線圖 Fig.7 Response surface plot and contour plot of Y=f(A,B)

圖7表明,在硝酸銨一定的情況下,蛋白胨和乳糖的交互作用顯著,隨著蛋白胨和乳糖含量的增加,乳糖酸的產量開始不斷提高,后期呈現小幅下降。一定程度上,提高培養基中蛋白胨和乳糖的含量有利于提高乳糖酸的產量,蛋白胨的變化對乳糖酸產量的影響沒有乳糖明顯,乳糖濃度過高會抑制菌體生長,不利于乳糖酸產量的增加。

由圖8可知,在蛋白胨一定的情況下,隨著硝酸銨和乳糖含量的增加,乳糖酸的產量開始不斷提高,后期呈現小幅下降。一定程度上,提高培養基中硝酸銨和乳糖的含量有利于提高乳糖酸的分泌和積累,但乳糖濃度過高會抑制菌體生長,不利于乳糖酸產量的增加。

圖8 Y=f(A,C)的響應面分析圖及其等高線圖 Fig.8 Response surface plot and contour plot of Y=f(A,C)

由圖9可知,在乳糖一定的情況下,蛋白胨和硝酸銨的交互作用較顯著,隨著蛋白胨和硝酸銨含量的增加,乳糖酸的產量不斷提高,但硝酸銨對乳糖酸產量的影響不及蛋白胨對乳糖酸產量的影響。

圖9 Y=f(B,C)的響應面分析圖及其等高線圖 Fig.9 Response surface plot and contour plot of Y=f(B,C)

2.7 培養基最佳濃度的確定

通過Design Expert8.0.5軟件分析得到最佳培養基組成:乳糖110.28g/L,蛋白胨19.00g/L,硝酸銨3.00g/L,在此條件下的乳糖酸產量的理論值為102.328g/L。

2.8 最佳發酵培養基的驗證

為了驗證建立的模型與實驗結果是否相符,根據最佳培養基組成配制發酵培養基,做3次平行實驗,RsoultellaterrigenaY20的乳糖酸產量為102.614g/L,與預測值相近。

3 結論

在單因素實驗的基礎上,經Plackett-Burman實驗確定乳糖、蛋白胨和硝酸銨為主要影響因素,在此基礎上進行最陡爬坡實驗,確定最佳響應面區域,然后采用Box-Behnken設計和Design Expert8.0.5軟件分析計算,得到這3種因素的添加量:乳糖110.28g/L,蛋白胨19.00g/L,硝酸銨3.00g/L,經實驗驗證,在此條件下乳糖酸產量為102.614g/L,轉化率為93.05%,比優化前的93.84g/L提高了9.35%。

利用微生物法將乳糖轉化為乳糖酸是一種簡單而有效的方法,生產成本較低,利于工業化生產?？梢詫ε囵B基的發酵條件進行優化,以期進一步地提高乳糖酸的產量。

[1]Tasic-Kostov M,Savic S,Lukic M,etal. Lactobionic acid in a natural alkylpolyglucoside-based vehicle:assessing safety and efficacy aspects in comparison to glycolic acid[J]. Journal of Cosmetic Dermatology,2010,9:3-10.

[2]Barbara A,Green. Hydroxy Acids and Beyond[J].Pierce Mattie Public Relations Inc Cosmetic Forecast,2004:38-41.

[3]Ahmad S K,Brinch D S,Friis E P,etal. Toxicological Studies on Caltose Oxidase from Microduchium mivale expreused in Fusdrium Venenatum[J].Regu Latory toxicology and pharmacology,2004,39(3):256-270.

[4]Southard J H,Belzer F O. Organ preservation[J],Annu Rev Med,1995,46:235-247.

[5]Jain N K,Jain S K. Development andinvitrocharacterization of galactosylated low molecular weight chitosan nanoparticles bearing doxorubicin[J]. American Association of pharmaceutical Scientists,2010,11:686-697.

[6]Maki-Arvela P,Murzina E V,Campo B,etal. The effect of palladium dispersion and promoters on lactose oxidation kinetics[J]. Research on Chemical Intermediates,2010,36:423-442.

[7]Maki-Arvela P,Tokarev A V,Murzina E V,etal. Kinetics of lactose and rhamnose oxidation over supported metal catalysts[J]. Physical Chemistry Chemical Physics,2011,13:9268-9280.

[8]Belkacemi K,Hamoudi S. Chemocatalytic oxidation of lactose

to lactobionic acid over PdeBi/SBA-15:reaction kinetics and modeling[J]. Industrial and Engineering Chemistry Research,2010,49:6878-6889.

[9]Pedruzzi I,Borges daSilva E A,Rodrigues A E. Production of lactobionic acid and sorbitol from lactose/fructose substrate using GFOR/GL enzymes from Zymomonas mobilis cells:a kinetic study[J]. Enzyme and Microbial Technology,2011,49:183-191.

[10]Van Hecke W,Bhagwat A,Ludwig R,etal. Kinetic modeling of a bi-enzymatic system for efficient conversion of lactose to lactobionic acid[J]. Biotechnology and Bioengineering,2009,102:1475-1482.

[11]Van Hecke W,Ludwig R,Dewulf J,etal. Bubble-free oxygenation of a bi-enzymatic system:effect on biocatalyst stability[J]. Biotechnology and Bioengineering,2009,102:122-131.

[12]Alonso S,Rendueles M,Diaz M. Efficient lactobionic acid production from whey by Pseudomonas taetrolens under pH-shift conditions[J]. Bioresource Technology,2011,102:9730-9736.

[13]Alonso S,Rendueles M,Diaz M. Role of dissolved oxygen availability on lactobionic acid production from whey by Pseudomonas taetrolens[J]. Bioresource Technology,2012,109:140-147.

[14]Murakami H,Seko A,Azumi M,etal. Microbial Conversion of Lactose to Lactobionic Acid by Resting Cells ofBurkholderiacepaciaNo.24[J]. Japanese Applied Glycoscience,2006,53(1):7-11.

[15]Gutiérrez L-F,Hamoudi S,Belkacemi K. Lactobionic acid:A high value-added lactose derivative for food and pharmaceutical applications[J].International Dairy Journal,2012,5:1-9.

[16]葛珍珍,王杰,周燦燦,等.響應面法優化小球藻培養基[J].食品工業科技,2012,33(16):195-200.

[17]李文婧,趙祥穎,田延軍,等.γ-聚谷氨酸產生菌的發酵培養基優化[J].食品與發酵工業,2010,36(3):108-116.