酶法制備金針菇提取物的工藝研究

，，

(1.廣東輕工職業技術學院，廣東廣州 510300；2.廣東高校特色調味品工程技術開發中心，廣東廣州 510300；3.廣西工學院，廣西柳州 545006； 4.廣州市味研生物工程科技有限公司，廣東廣州 510300)

金針菇富含蛋白質，還含有VB1、VB2、VC等多種維生素，且富含鈣、磷、鐵等多種礦物質，含有18 種氨基酸，其中有8 種是人體必需的氨基酸，占總氨基酸量的42.29%～51.17%。金針菇還含有多種具有生理活性的物質，如具有抗癌作用的多糖[1]。金針菇提取物作為一種天然、安全、營養、美味的調味基料風靡于國際市場，但在國內，研究多在于其營養和藥用價值，如李娟娟[2]等人采用木瓜蛋白酶與纖維素酶復合處理，使金針菇多糖得率可達2.56%。金針菇提取物口感方面的研究很少，作為調味料使用的報道也很少見。宋超[3]通過熱燙榨汁及濃縮干燥工藝得到的金針菇精具有濃郁的金針菇清香風味，但沒有研究說明其營養成分及調味效果。

筆者在研究了物理方法破壁制備金針菇提取物后，研究加入外源酶破壁制備金針菇提取物，以期獲得口感更佳，營養成分更全面的天然調味液。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金針菇 市售；木瓜蛋白酶800u/mg、纖維素酶1800u/mg、果膠酶1000u/mg 廣州市齊云生物技術有限公司；甲醛、鹽酸 廣州化學試劑廠；無水硫酸銅、濃硫酸 天津市永達化學試劑有限公司；酒石酸鉀鈉 天津市大茂化學試劑廠；氫氧化鈉 分析純，廣州市海珠化學試劑有限公司；濃硫酸 化學純，廣州市白云區良田光明化工廠；硫酸鉀 分析純，廣州化學試劑廠；無水乙醇 分析純，天津市永大化學試劑有限公司；濃硫酸 95%～98%,廣州市白云區良田光明化工廠；苯酚 廣州富星榮化工。

S22pc型可見光光度計 西安明克斯檢測設備有限公司；XO-150型超聲波細胞破碎儀 南京先歐生物科技有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海申賢恒溫設備廠；SH2-DⅢ型循環水式真空泵 超杰實驗儀器有限公司；pH-3便攜式pH計 深圳市鼎鑫宜實驗設備有限公司；HJ-6多頭磁力加熱攪拌器 金壇良友實驗儀器廠；500g搖擺試高速中藥粉碎機 溫嶺市創力藥材器械廠；數顯鼓風干燥箱 上海博訊事業有限公司醫療設備廠；消化爐HYP-1020 深圳市博大精科技實業有限公司；凱氏定氮蒸餾100KJELTEC 蘇州市天威儀器有限公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 破壁提取方法 考慮到綜合利用金針菇采摘后的廢渣，以及鮮菇大量產出而價格低廉時菇農的經濟利益，將鮮菇干燥延長儲存期后再酶解。將金針菇及廢渣洗凈置于50℃烘箱中烘12h，再經粉碎機粉碎成干粉，過40目篩，置于干燥箱中備用。根據真菌細胞壁結構，選取纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶三種酶作為外源酶，考察酶解溫度、pH、時間、加酶量對這三種酶破壁效果的影響，分別采用以下方式處理后，將樣品冷卻定容到100mL，布氏漏斗抽濾，制成樣液，測定其中蛋白質、氨基酸、多糖含量(以mg/g金針菇粉計)并品嘗評分。

1.2.1.1 纖維素酶酶解法 酶解溫度對纖維素酶破壁效果的影響：取5g金針菇粉加入70mL水，置于燒杯中浸泡30min，調pH至4.0，加入1%的酶液，分別在40、45、50、55℃下酶解2h。

酶解pH對纖維素酶破壁效果的影響：取5g 金針菇粉加入70mL水，置于燒杯中浸泡30min，分別調pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，加入1%的酶液，置于55℃下酶解2h。

酶解時間對纖維素酶破壁效果的影響：取5g 金針菇粉加入70mL水，置于燒杯中浸泡30min，調pH至4.0，加入1%的酶液，置于55℃下分別酶解1、2、3、4h。

加酶量對纖維素酶破壁效果的影響：取5g金針菇粉加入70mL水，置于燒杯中浸泡30min，調pH至4.0，分別加入1%、2%、3%的酶液，置于55℃下酶解2h。

1.2.1.2 果膠酶酶解法 酶解溫度對果膠酶破壁效果的影響：取5g 金針菇粉加入70mL水，置于燒杯中浸泡30min，調pH至3.5，加入1%的酶液，分別在45、50、55、60℃下酶解2h。

酶解pH對果膠酶破壁效果的影響：取5g 金針菇粉加入70mL水，置于燒杯中浸泡30min，分別調pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，加入1%的酶液，置于55℃下酶解2h。

酶解時間對果膠酶破壁效果的影響：取5g 金針菇粉加入70mL水，置于燒杯中浸泡30min，調pH至4.5，加入1%的酶液，置于55℃下分別酶解1、2、3、4h。

加酶量對果膠酶破壁效果的影響：取5g金針菇粉加入70mL水，置于燒杯中浸泡30min，調pH至3.5，分別加入1%、2%、3%的酶液，置于55℃下酶解2h。

1.2.1.3 木瓜蛋白酶酶解法 酶解溫度對木瓜蛋白酶破壁效果的影響：取5g 金針菇粉加入70mL水，置于燒杯中浸泡30min，調pH至6.5，加入1%的酶液，分別在45、50、55、60、65℃下酶解2h。

酶解pH對木瓜蛋白酶破壁效果的影響：取5g 金針菇粉加入70mL水，置于燒杯中浸泡30min，分別調pH至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，加入1%的酶液，置于45℃下酶解2h。

酶解時間對木瓜蛋白酶破壁效果的影響：取5g金針菇粉加入70mL水，置于燒杯中浸泡30min，調pH至6.5，加入1%的酶液，置于55℃下分別酶解1、2、3、4h。

加酶量對木瓜蛋白酶破壁效果的影響：金針菇粉加入70mL水，置于燒杯中浸泡30min，調pH至6.5，分別加入1%、2%、3%的酶液，置于55℃下，酶解2h。

1.2.1.4 三種酶混合酶解法 考慮到三種酶分步加入對于條件的調節比較繁瑣，而且作為天然調味液也不允許加入過多的化學試劑，筆者考察了三種酶等比例混合后同時加入的情況，從酶解溫度、酶解時間、pH、加酶量這幾個因素出發，設計了四因素三水平的正交試驗，因素與水平見表1。

表1 三種酶混合正交法制備 金針菇提取物試驗的因素水平表Table 1 Coded variables and their coded levels in orthogonal test of the three enzymes hydrolysis together to get the flammulina velutipes extract

1.2.2 檢測方法 參考文獻[4]中的方法。

1.2.2.1 蛋白質 采用凱氏定氮法。

1.2.2.2 多糖 采用苯酚硫酸法測總糖，DNS法測還原糖，兩者相減即為多糖含量。

1.2.2.3 氨基態氮 采用雙指示劑甲醛滴定法。

1.2.2.4 感官鑒定 品嘗前準備好一杯漱口水，每次品嘗后都要漱口，排除前一組的影響。

評定步驟：將每次抽濾完的樣液，取20mL于小燒杯中，在溫和的自然光下觀看其色澤；搖蕩小燒杯，觀察其粘稠度，是否澄清；將小燒杯的樣品緩緩搖動，用鼻子嗅其味道，另取樣品5mL于燒杯中用水浴鍋加熱到50℃，再嗅其味道；將樣品用吸管吸取幾滴滴入舌中央，使舌頭涂勻，感覺頭香，然后深呼吸，感覺是否有回香。評分標準見表2。

表2 評分標準(分)Table 2 Scoring standard

2 結果與分析

2.1 溫度、pH、時間、加酶量對纖維素酶酶解制備金針菇提取物的影響

溫度、pH、時間、加酶量對纖維素酶酶解的影響分別如圖1～圖4所示。由圖可知，纖維素酶作用于金針菇最好的工藝流程為：酶解溫度為50℃，pH為4.0，反應時間為2h，加酶量為2%。

圖1 溫度對纖維素酶制備金針菇提取物的影響 Fig.1 Effect of temperature on cellulase preparing Flammulina velutipes extract

圖2 pH對纖維素酶制備金針菇提取物的影響 Fig.2 Effect of pH on cellulase preparing Flammulina velutipes extract

圖3 時間對纖維素酶制備金針菇提取物的影響 Fig.3 Effect of time on cellulase preparing Flammulina velutipes extract

圖4 加酶量對纖維素酶制備金針菇提取物的影響 Fig.4 Effect of enzyme concentration on cellulase preparing Flammulina velutipes extract

2.2 溫度、pH、時間、加酶量對果膠酶酶解制備金針菇提取物的影響

溫度、pH、時間、加酶量對纖維素酶酶解的影響分別如圖5～圖8所示。由圖可知，果膠酶作用于金針菇最好的工藝流程為：酶解溫度55℃，pH為5.0，反應時間為4h，加酶量為3%。與纖維素酶相比，在同一條件下果膠酶對金針菇的作用效果要好于纖維素酶。

圖5 溫度對果膠酶酶制備金針菇提取物的影響 Fig.5 Effect of temperature on pectinase preparing Flammulina velutipes extract

圖6 pH對果膠酶制備金針菇提取物的影響 Fig.6 Effect of pH on pectinase preparing Flammulina velutipes extract

圖7 時間對果膠酶制備金針菇提取物的影響 Fig.7 Effect of time on pectinase preparing Flammulina velutipes extract

圖8 加酶量對果膠酶制備金針菇提取物的影響 Fig.8 Effect of enzyme concentration on pectinase preparing Flammulina velutipes extract

2.3 溫度、pH、時間、加酶量對木瓜蛋白酶酶解制備金針菇提取物的影響

溫度、pH、時間、加酶量對纖維素酶酶解的影響分別如圖9～圖12所示。由圖可知，木瓜蛋白酶作用于金針菇最好的工藝流程為：酶解溫度45℃，pH為6.5，反應時間為3h，加酶量為2%。與纖維素酶、果膠酶相比，木瓜蛋白酶對金針菇的作用效果總體上要好一些。

圖9 溫度對木瓜蛋白酶制備金針菇提取物的影響 Fig.9 Effect of temperature on papain preparing Flammulina velutipes extract

圖10 pH對木瓜蛋白酶制備金針菇提取物的影響 Fig.10 Effect of pH on papain preparing Flammulina velutipes extract

圖11 時間對木瓜蛋白酶制備金針菇提取物的影響 Fig.11 Effect of time on papain preparing Flammulina velutipes extract

圖12 加酶量對木瓜蛋白酶制備金針菇提取物的影響 Fig.12 Effect of enzyme concentration on papain preparing Flammulina velutipes extract

2.4 三種酶混合酶解法制備金針菇提取物的正交實驗結果

將各組試驗分別進行三次，取平均值，結果見表3。

表3 三種酶混合酶解正交試驗結果Table 3 Orthogonal test results of the three enzymes hydrolysis together

表4 三種酶混合酶解正交復證試驗結果Table 4 Repeated verification of the three enzymes hydrolysis together

由表3可知，從直觀分析可以分析出，在9組實驗中，多糖、氨基態氮、品嘗分數的最佳條件為A2B3C1D2，此條件下，蛋白質含量也較高。而由極差分析可知，蛋白質、氨基態氮、多糖、與品評的最佳組合都不一致，分別為A3B3C3D2、A3B3C1D1、A2B2C3D2和A1B3C3D2。四個因素中氨基態氮含量影響最大的是加酶量，其余影響最大的因素是酶解時間。

正交試驗復證：為得到最佳工藝條件，將這幾種未經試驗的組合各進行三次試驗復證，結果平均值如表4，綜合正交及復證結果，從蛋白質、氨基態氮含量以及品評分數來看，三種酶混合正交法中最佳組合應為A1B3C3D2，但此條件下得到的多糖含量卻不高，考慮到本課題旨在制備天然調味液，品評分數更為重要，故選擇最佳組合A1B3C3D2，即酶解溫度為40℃，pH為6.0，酶解時間為3h，加酶量為2%，此條件下得到的金針菇提取物蛋白質含量為153.80mg/g，氨基態氮含量為13.44mg/g，多糖含量為49.67mg/g，品評分數為70分。

3 結論

本實驗研究了外源酶酶解法對金針菇的主要營養成分和風味的影響，綜合看來，三種酶混合酶解法要明顯優于單一酶解法。最后得到最佳的提取工藝為：酶解溫度為40℃，pH為6.0，酶解時間為3h，三種酶混合加酶量為2%，此條件下得到的金針菇提取物蛋白質含量為153.80 mg/g，氨基態氮含量為13.44mg/g，多糖含量為49.67 mg/g，品評分數為70分。

通過單因素試驗及正交試驗，得到的最佳工藝下的金針菇提取物營養物質較全面，含量損失較少，但從風味上來說，還無法達到天然調味料的要求，且與物理法相比，沒有明顯的優勢。因此，還應考慮采用物理法與酶法相結合，或多酶分步提取法，也可調整條件，使其發生適當的美拉德反應以增加風味物質的生成等。

[1] 蔡和暉，廖森泰，葉運濤，等.金針菇的化學成分、生物活性及加工研究進展[J].食品研究與開發，2008,29:171-175.

[2] 李娟娟，董文娟，鄭義. 基于響應面法的復合酶輔助提取金針菇多糖的工藝優化[J]. 食品工程，2011(10):152-155.

[3] 宋超.金針菇精生產技術[J].食品工業，1994(2):35-37.

[4] 黃敏.物理法制備金針菇提取物的正交試驗研究[J].食品科技，2012,37:201-204.